1. የመጀመሪያ ግንዛቤ
በዚህ ደረጃ አንዳንድ ፅንሰ-ሀሳቦችን እና የቃላትን ቃላትን መረዳት አለብን, ስለዚህም በአዛውንቶቻችን ፊት ስህተቶችን እንዳንሰራ, ለምሳሌ:
ጥ፡ በRT-PCR፣ qPCR፣ Real-time PCR እና Real-time RT-PCR መካከል ያለው ልዩነት ምንድን ነው?
መልስ፡ RT-PCR በግልባጭ ግልባጭ PCR ነው።(ግልባጭ ግልባጭ PCR፣ RT-PCR)፣ እሱም በስፋት ጥቅም ላይ የዋለ የ polymerase chain reaction (PCR) ልዩነት ነው።በ RT-PCR ውስጥ፣ የአር ኤን ኤ ስትራንድ በግልባጭ ወደ ማሟያ ዲ ኤን ኤ ይገለበጣል፣ ከዚያም በ PCR ለዲኤንኤ ማጉላት እንደ አብነት ያገለግላል።
ሪል-ጊዜ-PCR እና qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) አንድ አይነት ነገር ናቸው፣ ሁለቱም የእውነተኛ ጊዜ አሃዛዊ PCR ናቸው፣ ይህ ማለት እያንዳንዱ የ PCR ዑደት የእውነተኛ ጊዜ የውሂብ መዝገቦች አሉት ማለት ነው፣ ስለዚህ የመነሻ አብነቶች ብዛት ትክክለኛ ትንታኔ ሊስተካከል ይችላል።
ምንም እንኳን ሁለቱም የሪል-ታይም PCR (የሪል-ታይም ፍሎረሰንት መጠናዊ PCR) እና የተገላቢጦሽ ግልባጭ PCR (ተገላቢጦሽ ፒሲአር) በአህጽሮት እንደ RT-PCR ያሉ ቢመስሉም፣ ዓለም አቀፍ ኮንቬንሽኑ ግን፡ RT-PCR በተለይ በግልባጭ የጽሑፍ ግልባጭን ይመለከታል።PCR , Real-time PCR በአጠቃላይ እንደ qPCR (መጠኑ የእውነተኛ ጊዜ PCR) ምህጻረ ቃል ነው..
እና የእውነተኛ ጊዜ RT-PCR (RT-qPCR) ከፍሎረሰንት መጠናዊ ቴክኖሎጂ ጋር የተጣመረ የተገላቢጦሽ ግልባጭ PCR ነው።በመጀመሪያ ሲዲ ኤን ኤ (RT) ከአር ኤን ኤ በግልባጭ ግልባጭ ያግኙ እና ከዚያ ለቁጥራዊ ትንተና (qPCR) Real-time PCR ይጠቀሙ።አብዛኛዎቹ ላቦራቶሪዎች RT-qPCR ን ያከናውናሉ ፣ ማለትም ፣ ስለ አር ኤን ኤ አገላለጽ ወደ ታች ቁጥጥር ያደርጋሉ ፣ ስለሆነም ሁሉም ሰው በቤተ ሙከራ ውስጥ የሚያወራው qPCR በእውነቱ RT-qPCRን ይመለከታል ፣ ግን አሁንም በክሊኒካዊ አፕሊኬሽኖች ውስጥ ብዙ የዲኤንኤ ምርመራዎች እንዳሉ አይርሱ።እንደ የሄፐታይተስ ቢ ቫይረስ ኤች.ቢ.ቪ መለየት የመሳሰሉ የቁጥር ትንተና።
ጥያቄ፡ ብዙ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ካነበቡ በኋላ፣ የተጨመረው ቁርጥራጭ በ80-300ቢፒ ክልል ውስጥ ለምን ቁጥጥር ይደረግበታል?
መልስ: የእያንዳንዱ የጂን ቅደም ተከተል ርዝመት የተለየ ነው, አንዳንዶቹ ብዙ ኪቢ ናቸው, አንዳንዶቹ በመቶዎች የሚቆጠሩ bp ናቸው, ነገር ግን ፕሪመርን በሚፈጥሩበት ጊዜ የምርት ርዝመት 80-300bp እንዲሆን ብቻ እንፈልጋለን, በጣም አጭር ወይም በጣም ረጅም ለፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ማወቂያ ተስማሚ አይደሉም.የምርት ቁርጥራጭ ከፕሪመር-ዲመር ለመለየት በጣም አጭር ነው.የፕሪመር-ዲመር ርዝመት ከ30-40ቢፒቢ ነው, እና ከ 80bp ያነሰ ከሆነ ፕሪመር-ዲመር ወይም ምርት መሆኑን ለመለየት አስቸጋሪ ነው.የምርት ስብርባሪው በጣም ረጅም ከሆነ ከ 300ቢፒ በላይ ከሆነ በቀላሉ ወደ ዝቅተኛ የማጉላት ቅልጥፍና ይመራል እና የጂንን መጠን በትክክል ማወቅ አይችልም.
ለምሳሌ በክፍል ውስጥ ስንት ሰዎች እንዳሉ ሲቆጥሩ ምን ያህል አፍ እንዳለ ብቻ መቁጠር ያስፈልግዎታል።ጂኖችን ሲያገኙም ተመሳሳይ ነገር ነው፣ እርስዎ ለመወከል የተወሰነ የጂን ቅደም ተከተል ብቻ መፈለግ ያስፈልግዎታል አጠቃላይ ቅደም ተከተል ይከናወናል።ሰዎችን ለመቁጠር ከፈለጉ ሁለቱንም አፍ እና አፍንጫ, ጆሮ እና መነጽር መቁጠር ያስፈልግዎታል, እና ስህተት ለመስራት ቀላል ነው.
ለማስፋፋት ፣ በባዮሎጂካል ምርምር ፣ ከቦታ ወደ ቦታ ብዙ የምርምር ጉዳዮች አሉ ፣ ምክንያቱም የማንኛውም ዝርያ የጂን ቅደም ተከተል በጣም ረጅም ነው ፣ አላስፈላጊ እና ሁሉንም ቁርጥራጮች ለመለካት የማይቻል ነው ፣ እንደ ባክቴሪያል 16S ቅደም ተከተል ፣ ይህም የባክቴሪያዎችን ወግ አጥባቂ ቅደም ተከተል ማከናወን ነው የተወሰኑ የባክቴሪያዎችን ብዛት ለመገመት Assays።
ጥ: ለqPCR ፕሪመር ንድፍ በጣም ጥሩው ርዝመት ምን ያህል ነው?
መልስ: በአጠቃላይ አነጋገር, የፕሪመር ርዝመት ከ20-24bp ነው, ይህም የተሻለ ነው.እርግጥ ነው, ፕሪመርን በሚነድፉበት ጊዜ ለዋናው የቲኤም ዋጋ ትኩረት መስጠት አለብን, ምክንያቱም ይህ ከትክክለኛው የአነቃቂ ሙቀት ጋር የተያያዘ ነው.ከብዙ ሙከራዎች በኋላ, 60 ° ሴ የተሻለ የቲኤም እሴት እንደሆነ ተረጋግጧል.የማጥቂያው ሙቀት በጣም ዝቅተኛ ከሆነ በቀላሉ ወደማይታወቅ ማጉላት ይመራል.የማጥቂያው ሙቀት በጣም ከፍተኛ ከሆነ የማጉላት ብቃቱ በአንጻራዊነት ዝቅተኛ ይሆናል, የማጉላት ከርቭ ጫፍ በኋላ ይጀምራል, እና የሲቲ ዋጋው ዘግይቷል.
ጥ፡ የማቅለሚያ ዘዴው ከምርመራው ዘዴ የሚለየው እንዴት ነው?
መልስ: ማቅለሚያ ዘዴእንደ SYBR Green Ⅰ፣ PicoGreen፣ BEBO፣ ወዘተ ያሉ አንዳንድ የፍሎረሰንት ቀለሞች በራሳቸው ብርሃን አያመነጩም፣ ነገር ግን ከትንሽ የዲ ኤን ኤ ግሩቭ ጋር ከተያያዙ በኋላ ፍሎረሰንት ያመነጫሉ።ስለዚህ, በ PCR ምላሽ መጀመሪያ ላይ ማሽኑ የፍሎረሰንት ምልክትን መለየት አይችልም.ምላሹ ወደ ማደንዘዣ-ኤክስቴንሽን ደረጃ ላይ ሲደርስ ድርብ ክሩ ይከፈታል እና በዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ተግባር ስር አዲስ ፈትል ይዋሃዳል እና የፍሎረሰንት ሞለኪውል ከ dsDNA አነስተኛ ጎድጎድ ጋር ይያያዛል።የ PCR ዑደቶች ቁጥር እየጨመረ በሄደ ቁጥር ቁጥራቸው እየጨመረ የመጣ ማቅለሚያዎች ከባለ ሁለት ክር ዲ ኤን ኤ ጋር ይጣመራሉ, እና የፍሎረሰንት ምልክትም ያለማቋረጥ ይጨምራል.የማቅለሚያ ዘዴው በዋናነት በሳይንሳዊ ምርምር ውስጥ ጥቅም ላይ ይውላል.
PS: ሙከራውን በሚያደርጉበት ጊዜ ይጠንቀቁ, ቀለም ከሰው ዲ ኤን ኤ ጋር መቀላቀል አለበት, ወደ ፍሎረሰንት ሰው ለመቀየር ይጠንቀቁ.
ማቅለሚያ ዘዴ (ግራ) የመመርመሪያ ዘዴ (በስተቀኝ)
PS: ሙከራውን በሚያደርጉበት ጊዜ ይጠንቀቁ, ቀለም ከሰው ዲ ኤን ኤ ጋር መቀላቀል አለበት, ወደ ፍሎረሰንት ሰው ለመቀየር ይጠንቀቁ.
SYBR አረንጓዴ Ⅰ ከዲኤንኤ ትንሹ ጎድጎድ ጋር ይያያዛል
የመመርመሪያ ዘዴTaqman probe በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለው የሃይድሮሊሲስ ምርመራ ነው።በምርመራው 5′ ጫፍ ላይ የፍሎረሰንት ቡድን አለ፣ ብዙ ጊዜ FAM፣ እና ፍተሻው ራሱ ከዒላማው ዘረ-መል ጋር የሚመጣጠን ቅደም ተከተል ነው።በ3′ መጨረሻ ላይ የፍሎረሰንት ማጥፊያ ቡድን አለ።በፍሎረሰንት ሬዞናንስ ኢነርጂ ሽግግር መርህ መሰረት (Förster resonance energy transfer, FRET), ዘጋቢው የፍሎረሰንት ቡድን (ለጋሽ ፍሎረሰንት ሞለኪውል) እና የሚያጠፋው የፍሎረሰንት ቡድን (ተቀባይ ፍሎረሰንት ሞለኪውል) ሲደሰቱ ስፔክትራ ሲደራረቡ እና ርቀቱ በጣም ቅርብ በሆነበት ጊዜ (7-10n የፍሎረሰንት ሞለኪውል) ፍሎረሰንት ፍሎረሰንት ሲቀበል)። ሞለኪውል, autofluorescence ሲዳከም.ስለዚህ, በ PCR ምላሽ መጀመሪያ ላይ, ፍተሻው ነፃ እና በሲስተሙ ውስጥ ያልተነካ, የሪፖርተር ፍሎረሰንት ቡድን ፍሎረሰንት አይፈጥርም.በሚሰርዙበት ጊዜ ፕሪመር እና መፈተሻ ከአብነት ጋር ይያያዛሉ።በማራዘሚያው ደረጃ, ፖሊሜሬዝ ያለማቋረጥ አዳዲስ ሰንሰለቶችን ያዘጋጃል.ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ 5′-3′ exonuclease እንቅስቃሴ አለው።ወደ ፍተሻው ሲደርሱ የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ መፈተሻውን ከአብነት ውስጥ በሃይድሮላይዝ ያደርገዋል፣ ዘጋቢውን የፍሎረሰንት ቡድን ከኩዌንቸር ፍሎረሰንት ቡድን ይለያል እና የፍሎረሰንት ምልክቱን ይለቃል።በመመርመሪያው እና በአብነት መካከል የአንድ ለአንድ ግንኙነት ስላለ፣ የፈተና ዘዴው ከሙከራው ትክክለኛነት እና ስሜታዊነት አንፃር ከቀለም ዘዴ የላቀ ነው።የመመርመሪያ ዘዴው በዋናነት በምርመራው ውስጥ ጥቅም ላይ ይውላል.
ጥ፡ ፍፁም መጠናዊ ምንድን ነው?Relative Quantification ምንድን ነው?
መልስፍፁም ቁጥሩ በqPCR የሚመረመረውን የናሙናውን የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር ስሌት ማለትም በ1 ሚሊር ደም ውስጥ ስንት ኤችቢቪ ቫይረሶች እንዳሉ ያሳያል።በአንፃራዊ ሁኔታ የተገኘው ውጤት ከሌላ ማጣቀሻ ናሙና አንጻር በተወሰነ ናሙና ውስጥ ያለው የዒላማ ዘረ-መል መጠን ለውጥ ሲሆን የጂን አገላለጽ የተስተካከለ ወይም የተስተካከለ ነው።
ጥ፡ የአር ኤን ኤ ማውጣት፣ የመገለባበጥ ቅልጥፍና፣ እና የማጉላት ቅልጥፍና በሙከራ ውጤቶቹ ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል?
ጥ፡ የናሙና ማከማቻ፣ የማውጣት ሪጀንቶች፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ሪጀንቶች እና ብርሃን አስተላላፊ የፍጆታ ዕቃዎች በሙከራ ውጤቶቹ ላይ ተጽዕኖ ያሳድራሉ?
ጥ: - የሙከራ መረጃን የሚያስተካክለው የትኛው ዘዴ ነው?
እነዚህን ጉዳዮች በተመለከተ ከዚህ በታች ባሉት የላቁ እና የላቁ ክፍሎች በዝርዝር እንገልጻቸዋለን።
2. የላቀ እውቀት
የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCRን በተመለከተ በሺዎች የሚቆጠሩ ሳይንሳዊ የምርምር ወረቀቶች በየዓመቱ እንደሚታተሙ እውነታውን መገንዘብ አለብን ፣ ከእነዚህም መካከል የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ቴክኖሎጂ አነስተኛ ቁጥር አይደለም።
የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ሙከራን ለመለካት ምንም ዓይነት የተለመደ መስፈርት ከሌለ ውጤቶቹ በስፋት ሊለያዩ ይችላሉ።ለተመሳሳይ ዝርያ ተመሳሳይ ዘረ-መል (ጅን)፣ በተመሳሳዩ የማቀነባበሪያ ዘዴ፣ የመለየት ውጤቶቹም በስፋት ይለያያሉ፣ እና ዘግይተው የመጡ ሰዎች ተመሳሳይ ውጤት ለመድገም አስቸጋሪ ይሆናል።የትኛው ትክክል እና ስህተት እንደሆነ ማንም አያውቅም።
ይህ ማለት የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR የማጭበርበር ቴክኖሎጂ ነው ወይስ የማይታመን ቴክኖሎጂ ነው?አይደለም፣ ምክንያቱም የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR የበለጠ ስሜታዊ እና የበለጠ ትክክለኛ ስለሆነ ነው፣ እና ትንሽ የተሳሳተ ክዋኔ ሙሉ በሙሉ ተቃራኒ ውጤቶችን ያመጣል።ትንሽ ኪሳራ አንድ ሺህ ማይል ርቀት ላይ ነው.የጽሁፉ ደራሲ በገምጋሚዎች በተደጋጋሚ ሊሰቃይ ይችላል።በተመሳሳይ ጊዜ የመጽሔቱ ገምጋሚዎች ከተለያዩ የሙከራ ውጤቶች ለመምረጥ አስቸጋሪ ናቸው.
በአጠቃላይ በእውነተኛ ጊዜ PCR ሙከራዎች ውስጥ የጋራ መግባባት አለመኖርን ያመለክታል.ለዚህም, በኢንዱስትሪው ውስጥ ያሉ ከፍተኛ ሳይንቲስቶች ደረጃዎችን ማዘጋጀት ጀመሩ.አስተዋፅዖ አበርካቾች በአንቀጹ ውስጥ አንዳንድ አስፈላጊ የሙከራ እና የውሂብ ሂደት ዝርዝሮችን (አስፈላጊውን ውሂብ ጨምሮ) እንዲያቀርቡ ይጠይቃል።
ገምጋሚዎች እነዚህን ዝርዝሮች በማንበብ የሙከራውን ጥራት መወሰን ይችላሉ;የወደፊት አንባቢዎች ይህን ሙከራውን ለመድገም ወይም ሙከራውን ለማሻሻል ሊጠቀሙበት ይችላሉ.ከዚያም በዚህ መንገድ የተገኙት የሙከራ ውጤቶች በመረጃ የተሞሉ, ከፍተኛ ጥራት ያላቸው እና ጥቅም ላይ የሚውሉ ናቸው.
MIBBI (ለባዮሎጂካል እና ባዮሜዲካል ምርመራዎች አነስተኛ መረጃ -http://www.mibbi.org) ተፈጠረ።MIBBI ለሙከራ ደረጃዎችን የሚሰጥ ፕሮጀክት ነው።.በተፈጥሮ ውስጥ ታትሟል.ይህ ፕሮጀክት ሴል ባዮሎጂ፣ ማይክሮአራይ፣ qPCR አሁን የምንወያይበት ወዘተ ጨምሮ በተለያዩ ባዮሎጂያዊ ሙከራዎች ላይ ያተኮረ ነው፣ እና የእጅ ጽሑፎችን በሚያስገቡበት ጊዜ ለእያንዳንዱ አይነት ሙከራ ያቀርባል።ያ መረጃ በማንኛውም ጊዜ መቅረብ አለበት.
በ MIBBI ፕሮጀክት ውስጥ፣ ከፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ጋር የተያያዙ ሁለት ጽሑፎች አሉ፣ እነሱም ናቸው።:
· RDML (በእውነተኛ ጊዜ PCR ውሂብ ማርክ ቋንቋ) - ለእውነተኛ ጊዜ የ PCR መረጃ የተዋቀረ ቋንቋ እና የሪፖርት ማቅረቢያ መመሪያ;
· MIQE (የቁጥር ሪል-ጊዜ PCR ሙከራዎችን ለማተም ዝቅተኛው መረጃ) - ስለ ቅጽበታዊ የ PCR ሙከራዎች መጣጥፎችን ለማተም አነስተኛ መረጃ።
በመጀመሪያ፣ ስለ አርዲኤምኤል፣ የቃላት ዝርዝር መግለጫ እንነጋገር።
ለሁሉም ነገር መደበኛ ትርጉም ከሌለ, ውይይቱን መቀጠል አይቻልም, ለዚህም ነው የቃላት ማብራሪያ በፈተና ውስጥ በጣም አስፈላጊ የሆነው.
በፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ሙከራ ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውለው የቃላት አጠቃቀም የሚከተለውን ይዘት ያካትታል።QIAGEN ምርጡን ማጠቃለያ አድርጎልናል።የሚከተሉት ሁሉ ደረቅ ናቸው።እቃዎች .
የማጉላት ኩርባ
የማጉላት ከርቭ በ PCR ሂደት ውስጥ የተሰራውን ኩርባ ያመለክታል፣ የዑደቱ ቁጥሩ እንደ abcissa እና የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠን እንደ ordinate ምላሽ ነው።
በጣም ጥሩ የሆነ የማጉላት ኩርባ የሚከተሉትን ባህሪያት ሊኖረው ይገባል: የመነሻው መስመር ጠፍጣፋ ወይም ትንሽ ቀንሷል, እና ምንም ግልጽ የሆነ ወደላይ የሚሄድ አዝማሚያ የለም;የጠመዝማዛው የመቀየሪያ ነጥብ ግልጽ ነው, እና የመለኪያው ደረጃ ቁልቁል ከማጉላት ውጤታማነት ጋር ተመጣጣኝ ነው.ቁልቁል የበለጠ, የማጉላት ውጤታማነት ከፍ ያለ ነው;የአጠቃላይ የማጉላት ኩርባ ትይዩ ጥሩ ነው, ይህም የእያንዳንዱ ቱቦ የማጉላት ብቃት ተመሳሳይ መሆኑን ያሳያል;የዝቅተኛ ትኩረት ናሙናዎች የማጉላት ኩርባ ገላጭ ደረጃ ግልፅ ነው።
መነሻ (መሰረታዊ)
መነሻው የመጀመርያው ዑደት የጩኸት ደረጃ ነው, ብዙውን ጊዜ የሚለካው በ 3 ኛ እና 15 ኛ ዑደት መካከል ነው, ምክንያቱም በማጉላት ምርቱ ምክንያት የሚፈጠረው የፍሎረሰንት ዋጋ መጨመር በዚህ ጊዜ ውስጥ ሊገኝ አይችልም.የመነሻ መስመሩን ለማስላት ጥቅም ላይ የሚውሉት ዑደቶች ብዛት ሊለያይ ይችላል እና ከፍተኛ የአብነት መጠን ጥቅም ላይ ከዋለ ወይም የዒላማው ዘረ-መል አገላለጽ ከፍተኛ ከሆነ መቀነስ ሊያስፈልግ ይችላል።
የመነሻ መስመርን ማዘጋጀት የፍሎረሰንት መረጃን ከመስመር የማጉላት ከርቭ መመልከትን ይጠይቃል።የመነሻ መስመሩ የተዘጋጀው የማጉላት ኩርባ እድገቱ ከመነሻ ዑደት ከፍተኛ ቁጥር በሚበልጥ ዑደት ቁጥር ይጀምራል።ለእያንዳንዱ የዒላማ ቅደም ተከተል መሰረትን በተናጠል ማዘጋጀት ያስፈልጋል.በመጀመሪያዎቹ ዑደቶች ውስጥ የሚገኙት አማካኝ የፍሎረሰንት እሴቶች በተጨመሩ ምርቶች ውስጥ ከሚገኙት የፍሎረሰንት እሴቶች መቀነስ ያስፈልጋል።የተለያዩ የሪል-ታይም PCR ሶፍትዌር የቅርብ ጊዜ ስሪቶች ለግለሰብ ናሙናዎች የመነሻ ቅንጅቶችን በራስ-ሰር ማመቻቸትን ይፈቅዳሉ።
በ PCR ማጉያ ምላሽ የመጀመሪያዎቹ ዑደቶች ውስጥ የፍሎረሰንት ምልክት ብዙም አይለወጥም።ወደ ቀጥታ መስመር መቅረብ መነሻ መስመር ይባላል ነገርግን የመጀመሪያዎቹን ጥቂት ዑደቶች በቅርበት ከተመለከትን በመነሻ መስመር ውስጥ ከታች በምስሉ ላይ እየተፈጠረ ያለው ነገር እንዳለ እናያለን።
ዳራ ዳራ የሚያመለክተው
በምላሹ ውስጥ ልዩ ያልሆነ የፍሎረሰንት እሴት .ለምሳሌ: ውጤታማ ያልሆነ የፍሎረሰንት ማጥፋት;ወይም በ SYBR አረንጓዴ አጠቃቀም ምክንያት ብዙ ቁጥር ያላቸው ባለ ሁለት ገመድ የዲኤንኤ አብነቶች።የምልክቱ ዳራ ክፍሎች በሪል-ታይም PCR ሶፍትዌር ስልተ ቀመር በሂሳብ ተወግደዋል።
የሪፖርተር ምልክት
የሪፖርተር ሲግናል የሚያመለክተው በSYBR አረንጓዴ የሚፈጠረውን የፍሎረሰንት ምልክት ወይም በሪል-ታይም PCR ወቅት በፍሎረሰንት ምልክት የተደረገባቸው ተከታታይ-ተኮር ፍተሻዎች ነው።
መደበኛ የሪፖርተር ሲግናል (አርኤን)
RN የሚያመለክተው በእያንዳንዱ ዑደት ላይ በሚለካው የፓሲቭ ማመሳከሪያ ቀለም በፍሎረሰንት መጠን የተከፋፈለው የሪፖርተር ቀለም የፍሎረሰንት መጠን ነው።
ተገብሮ ማመሳከሪያ ቀለም
በአንዳንድ Real-Time PCRs፣የፍሎረሰንት ቀለም ROX የፍሎረሰንት ምልክትን መደበኛ ለማድረግ እንደ ውስጣዊ ማጣቀሻ ጥቅም ላይ ይውላል.በጥሩ ሁኔታ መሰረት ትክክል ባልሆኑ የቧንቧ መስመሮች, የጉድጓድ አቀማመጥ እና የፍሎረሰንት መለዋወጥ ምክንያት ልዩነቶችን ያስተካክላል.
የፍሎረሰንት ጣራ (ጣራ)
ከበስተጀርባው እሴት በላይ እና በከፍተኛ ደረጃ ከማጉላት ከርቭ ፕላቱ ዋጋ በታች ተስተካክሏል።የ PCR ማወቂያን የሎግ-መስመራዊ ክልልን የሚወክል በማጉያው ከርቭ መስመራዊ ክልል ውስጥ መዋሸት አለበት።የ PCR ሎግ-ሊነር ደረጃ በቀላሉ መለየት እንዲችል በሎግ-ማጉላት ከርቭ እይታ ውስጥ ገደቦች መዘጋጀት አለባቸው።በሪል-ታይም PCR ውስጥ በርካታ የዒላማ ጂኖች ካሉ፣ ጣራው ለእያንዳንዱ ዒላማ መዘጋጀት አለበት።በአጠቃላይ የፍሎረሰንት ሲግናል የመጀመሪያው 15 ዑደቶች PCR ምላሽ እንደ fluorescence ዳራ ሲግናል ጥቅም ላይ ይውላል, እና fluorescence ደፍ 10 እጥፍ መደበኛ መዛባት PCR የመጀመሪያ 3 15 ዑደቶች ፍሎረሰንስ ሲግናል, እና ፍሎረሰንት amplifier ፒሲአርኤል ያለውን ደረጃ ውስጥ ተዘጋጅቷል.በአጠቃላይ እያንዳንዱ መሳሪያ ከመጠቀምዎ በፊት የተወሰነ የፍሎረሰንት ገደብ አለው።
የዑደት ገደብ (ሲቲ) ወይም ማቋረጫ ነጥብ (ሲፒ)
የማጉላት ኩርባው ገደቡን የሚያቋርጥበት ዑደት (ማለትም፣ የፍሎረሰንት መለየት በከፍተኛ ሁኔታ የሚጨምርበት ነጥብ)።ሲቲ ክፍልፋይ ሊሆን ይችላል እና የመነሻ አብነት መጠን ሊሰላ ይችላል።በእያንዳንዱ PCR ምላሽ ቱቦ ውስጥ ያለው የፍሎረሰንት ምልክት የተቀመጠው ገደብ ላይ ሲደርስ የሲቲ እሴቱ ያጋጠሙትን ዑደቶች ብዛት ይወክላል።በእያንዳንዱ አብነት የሲቲ እሴት እና በአብነት የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር ሎጋሪዝም መካከል ቀጥተኛ ግንኙነት አለ፣የመነሻ ቅጂው ቁጥር ከፍ ያለ, የሲቲ እሴት ያነሰ እና በተቃራኒው.አንድ መደበኛ ኩርባ የሚታወቅ የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር ያለው መደበኛ በመጠቀም ሊሠራ ይችላል ፣ በዚህ ውስጥ abcissa የሲቲ እሴትን ይወክላል ፣ እና ordinate የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር ሎጋሪዝምን ይወክላል።ስለዚህ, የማይታወቅ ናሙና የሲቲ እሴት እስካልተገኘ ድረስ, የናሙናው የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር ከመደበኛ ኩርባ ሊሰላ ይችላል.
ΔCT ዋጋ
ΔCT ዋጋ ይገልጻልበዒላማው ዘረ-መል እና በተዛማጅ ውስጣዊ የማጣቀሻ ጂን ሲቲ እሴት መካከል ያለው ልዩነትእንደ የቤት አያያዝ ጂን ያለ፣ እና ጥቅም ላይ የዋለውን የአብነት መጠን መደበኛ ለማድረግ ጥቅም ላይ ይውላል፡-
⇒ΔCT = ሲቲ (ዒላማ ዘረ-መል) - ሲቲ (የውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂን)
ΔΔCT ዋጋ
የ ΔΔCT እሴት በፍላጎት ናሙና አማካይ ΔΔCT እሴት መካከል ያለውን ልዩነት ይገልፃል (ለምሳሌ ፣ የተቀሰቀሱ ሴሎች) እና የማጣቀሻ ናሙና አማካይ ΔΔCT እሴት (ለምሳሌ ፣ ያልተነቃቁ ሕዋሳት)።የማመሳከሪያው ናሙና የካሊብሬሽን ናሙና ተብሎም ይጠራል እና ሁሉም ሌሎች ናሙናዎች ለዚህ አንጻራዊ መጠን መደበኛ ናቸው፡
⇒ΔΔCT = አማካኝ ΔCT (የፍላጎት ናሙና) - አማካኝ ΔCT (የማጣቀሻ ናሙና)
ውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂኖች (የውስጥ ማጣቀሻ ጂኖች)
እንደ የቤት አያያዝ ጂኖች (የቤት አያያዝ ጂኖች) ያሉ ውስጣዊ የማጣቀሻ ጂኖች አገላለጽ ደረጃዎች በናሙናዎች መካከል አይለያዩም።የማጣቀሻውን ዘረ-መል (CT) እሴቶችን ከተፈለገው ዘረ-መል (ጅን) ጋር ማነፃፀር የዒላማው ዘረ-መል (ጅን) አገላለጽ ደረጃ ወደ ግቤት አር ኤን ኤ ወይም ሲዲኤንኤ መጠን መደበኛ እንዲሆን ያስችላል (ከላይ በ ΔCT እሴቶች ላይ ያለውን ክፍል ይመልከቱ)።
የውስጥ ማጣቀሻ ጂኖች ትክክለኛ ለአር ኤን ኤ መበላሸት ወይም በአር ኤን ኤ ናሙናዎች ውስጥ የኢንዛይም አጋቾች መኖር፣ እንዲሁም የአር ኤን ኤ ይዘት ልዩነቶች፣ የግልባጭ ቅልጥፍና፣ የኑክሊክ አሲድ ማገገም እና የናሙና አያያዝ።በጣም ጥሩውን የማጣቀሻ ጂን(ዎች) ለመምረጥ፣ በሙከራ መቼት ላይ የሚመረኮዝ ምርጡን ማጣቀሻ እንዲመርጥ ለማድረግ ስልተ ቀመሩን ቀይረናል።
የውስጥ ቁጥጥር
የቁጥጥር ቅደም ተከተል እንደ ዒላማው ቅደም ተከተል በተመሳሳይ ምላሽ የተጠናከረ እና በተለየ መፈተሻ (ማለትም duplex PCR በማከናወን ላይ)።የውስጥ መቆጣጠሪያዎች ብዙ ጊዜ ያልተሳኩ ማጉላትን ለማስወገድ ያገለግላሉ፣ ለምሳሌ የዒላማው ቅደም ተከተል በማይገኝበት ጊዜ።
የመለኪያ ናሙና
የጂን አንጻራዊ አገላለጽ ደረጃን ለማወቅ ሁሉንም ሌሎች ናሙናዎችን ለማነፃፀር በአንፃራዊነት ጥቅም ላይ የዋለ የማመሳከሪያ ናሙና (ለምሳሌ ከሴል መስመር ወይም ቲሹ የተጣራ አር ኤን ኤ)።የመለኪያ ናሙናው ማንኛውም ናሙና ሊሆን ይችላል, ነገር ግን አብዛኛውን ጊዜ ቁጥጥር ነው (ለምሳሌ, ያልታከመ ናሙና ወይም ከሙከራው ጊዜ ዜሮ ናሙና).
አዎንታዊ መቆጣጠሪያዎች
የቁጥጥር ምላሾችን ይጠቀሙየታወቁ የአብነት መጠኖች.አወንታዊ ቁጥጥሮች ብዙውን ጊዜ የፕሪመር ስብስብ ወይም ፕሪመር-መመርመሪያ ስብስብ በትክክል እየሰራ መሆኑን እና ምላሹ በትክክል መዘጋጀቱን ለመፈተሽ ያገለግላሉ።
ምንም የአብነት መቆጣጠሪያ (ኤንቲሲ)
ከአብነት በስተቀር ሁሉንም አስፈላጊ የሆኑትን የማጉላት ምላሹን ያካተተ የቁጥጥር ምላሽ ፣ ይህም ብዙውን ጊዜ በውሃ ተተክቷል።የኤንቲሲ አጠቃቀም በሬጀንት ብክለት ወይም በውጪ ዲ ኤን ኤ ምክንያት የተፈጠረውን ብክለት ሊያገኝ ይችላል፣ በዚህም የፍተሻ መረጃውን ትክክለኛነት እና አስተማማኝነት ያረጋግጣል።የ NTC መቆጣጠሪያን ማጉላት ብክለትን ያመለክታል.
የ RT ቁጥጥር የለም (NRT)
የአር ኤን ኤ ማውጣት ሂደት እጅግ በጣም ጎጂ የሆነ እና በዳታ ጥራት ላይ ተፅዕኖ ያለው እና የqPCR የተፈጥሮ ጠላት የሆነው ቀሪ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ሊይዝ ይችላል፣ስለዚህ ሙከራዎችን ሲነድፍ አር ኤን ኤን ማወቅን ለማጉላት ብቻ የተነደፈ መሆን አለበት።ሁለት መንገዶች አሉ, አንደኛው በመግቢያው ላይ ፕሪመርን ማዘጋጀት ነው, ሌላኛው ደግሞ ዲ ኤን ኤ ሙሉ በሙሉ ማስወገድ ነው, የትኛው የተሻለ ነው, ይህም በኋላ ላይ ይብራራል.የNTR መቆጣጠሪያ የዲኤንኤ ብክለትን ለመለየት አስማታዊ መስታወት ነው።ማጉላት ካለ ብክለት አለ ማለት ነው።
ደረጃዎች
ደረጃዎች መደበኛ ኩርባ ለመገንባት የሚያገለግሉ የታወቁ የማጎሪያ ወይም የቅጂ ቁጥር ናሙናዎች ናቸው።ደረጃውን የጠበቀ መረጋጋትን ለማረጋገጥ የጂን ቁርጥራጭ አብዛኛውን ጊዜ ወደ ፕላዝሚድ (cloned) እና እንደ መደበኛ ጥቅም ላይ ይውላል.
መደበኛው ኩርባ
አብዛኛውን ጊዜ ቢያንስ በ 5 የማጎሪያ ግሬዲየንት ውስጥ ከመደበኛው ምርት ጋር በእጥፍ ጥምርታ መሰረት ይቀልጣል እና 5 ነጥቦች በሲቲ እሴት እና ኮፒ ቁጥር መጋጠሚያዎች ውስጥ ይሳላሉ እና ነጥቦቹ መስመር ለመመስረት መደበኛ ኩርባዎችን ይፈጥራሉ።ለእያንዳንዱ መደበኛ ኩርባ ትክክለኛነቱ መፈተሽ አለበት።የዳገቱ እሴቱ በ -3.3 እና -3.8 መካከል ይወድቃል፣ እና እያንዳንዱ ትኩረት በሦስት እጥፍ ይከናወናል።ከሌሎች ነጥቦች በእጅጉ የሚለዩ ነጥቦች መጣል አለባቸው።የሚሞከረው ናሙና የሲቲ እሴት ወደ መደበኛው ኩርባ ውስጥ ገብቷል, እና የሚሞከረው ናሙና አገላለጽ ደረጃ ሊሰላ ይችላል.
የሚሞከረው ናሙና የሲቲ እሴት ወደ መደበኛው ኩርባ ውስጥ ገብቷል, እና የሚሞከረው ናሙና የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር ሊሰላ ይችላል.
ቅልጥፍና እና ተዳፋት
የመደበኛ ኩርባ ቁልቁል የእውነተኛ ጊዜ PCR ቅልጥፍናን ይወክላል።
የ -3.322 ቁልቁል የሚያመለክተው PCR የማጉላት ብቃቱ 1 ወይም 100% ቀልጣፋ መሆኑን እና በእያንዳንዱ ዑደት የ PCR ምርት መጠን በእጥፍ ይጨምራል።
ከ -3.322 (ለምሳሌ -3.8) ያነሰ ተዳፋት የ PCR ቅልጥፍናን ያሳያል
ከ -3.322 (ለምሳሌ፡-3.0) የሚበልጥ ቁልቁል የ PCR ቅልጥፍና ከ 100% በላይ እንደሚመስል ያሳያል፣ ይህም የማወቅ ጉጉት ነው፣ አንድ የ PCR ዑደት የተሻሻለውን ምርት እንዴት ከእጥፍ በላይ ሊያመነጭ ይችላል?ይህ ሁኔታ የሚከሰተው በ PCR ምላሽ ባልሆነ መስመር ላይ ነው ፣ ማለትም ፣ ከፍተኛ መጠን ያለው ልዩ ያልሆነ ማጉላት አለ።
መቅለጥ ኩርባ
የqPCR ማጉላት ከተጠናቀቀ በኋላ የ PCR ምርቱ ይሞቃል.የሙቀት መጠኑ እየጨመረ ሲሄድ, ባለ ሁለት መስመር የማጉላት ምርት ቀስ በቀስ ይቀልጣል, በዚህም ምክንያት የፍሎረሰንት ጥንካሬ ይቀንሳል.የተወሰነ የሙቀት መጠን (ቲኤም) ሲደርስ ብዙ ቁጥር ያላቸው ምርቶች ይቀልጣሉ.ፍሎረሰንት በከፍተኛ ሁኔታ ይቀንሳል.የተለያዩ የ PCR ምርቶች የተለያዩ የቲኤም እሴቶች እና የተለያዩ የመቅለጥ ሙቀቶች አሏቸው, ስለዚህም የ PCR ልዩነት ሊታወቅ ይችላል.
መቅለጥ ከርቭ (የመነጨ ኩርባ)
የማቅለጫው ኩርባ የተገኘው ከፍተኛ ካርታ ለመመስረት ነው፣ ይህም የ PCR ምርት ቁርጥራጭ ሁኔታን የበለጠ በማስተዋል ማሳየት ይችላል።የሟሟ የሙቀት መጠን የዲኤንኤ ክፍልፋይ የቲኤም እሴት ስለሆነ፣ በዲኤንኤ ክፍልፋይ የቲኤም እሴት ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድሩ አንዳንድ መለኪያዎች እንደ ቁርጥራጭ መጠን፣ የጂሲ ይዘት፣ ወዘተ. በአጠቃላይ እንደ ፕሪመር ዲዛይን መርሆቻችንየተጨመረው ምርት ርዝመት ከ80-300ቢፒቢ ክልል ውስጥ ነው, ስለዚህ የሟሟ ሙቀት ከ 80 ° ሴ እስከ 90 ° ሴ መሆን አለበት.
የማቅለጫ ኩርባ ትርጓሜ: ብቸኛው ዋና ጫፍ በ 80 ° ሴ-90 ° ሴ መካከል ከታየ, የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ፍጹም ነው ማለት ነው;ዋናው ጫፍ ከ 80 ° ሴ - 90 ° ሴ እና ልዩ ልዩ ቁንጮዎች ከ 80 ° ሴ በታች ከታዩ የፕሪመር ዲመር በመሠረቱ ግምት ውስጥ ይገባል.እሱን ለመፍታት የመረበሽ ሙቀትን ለመጨመር መሞከር ይችላሉ;ዋናው ጫፍ ከ 80 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እስከ 90 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ከታየ እና ልዩነቱ ከፍተኛው የሙቀት መጠኑ ሲጨምር እንደገና ከታየ, በመሠረቱ የዲ ኤን ኤ ብክለት እንዳለ ይቆጠራል, እና ዲ ኤን ኤ በሙከራው የመጀመሪያ ደረጃ ላይ መወገድ አለበት.
እርግጥ ነው, አሁንም አንዳንድ ያልተለመዱ ሁኔታዎች አሉ, ከታች አንድ በአንድ ይከፋፈላሉ.
3. የላቀ እውቀት
qPCR ለመስራት MIQE ማለት አለብኝ፣ዝቅተኛ መረጃለህትመት የመጠናዊሪል-ታይም PCRሙከራዎች - ስለ እውነተኛ - የጊዜ መጠን PCR መጣጥፎችን ለማተም ዝቅተኛው መረጃሙከራዎች .የሁሉንም ሰው ግንዛቤ ለማቃለል ቁልፍ ይዘቱን እናቀላለን።
በበይነመረብ ላይ የ MIQE ኦሪጅናል ጽሑፍ መፈለግ ይችላሉ ፣ እና በጣም አስፈላጊው ነገር የሚደነግገው ነው።አንድ ጽሑፍ በሚታተምበት ጊዜ መቅረብ ያለበት የውሂብ ማረጋገጫ ዝርዝር .
ገምጋሚዎች እነዚህን ዝርዝሮች በማንበብ የሙከራውን ጥራት መወሰን ይችላሉ;የወደፊት አንባቢዎች ይህንን ሙከራ ለመድገም ወይም ለማሻሻል ሊጠቀሙበት ይችላሉ.
በዚህ ዝርዝር ውስጥ የእያንዳንዱ ዝርዝር አስፈላጊነት በ E ወይም D ምልክት የተደረገበት መሆኑን ልብ ሊባል የሚገባው ነው.ምን ማለት ነው?ኢ: አስፈላጊ መረጃ (መቅረብ አለበት);መ: ተፈላጊ መረጃ (በተቻለ መጠን ያቅርቡ)።
MIQE (1) -የሙከራ ንድፍ
የድህረ ምረቃ ትምህርታቸውን ከጨረሱ በኋላ መከላከያቸውን ያጠናቀቁ ብዙ አጭበርባሪዎች አንድን ሙከራ ለብቻቸው ይነድፉ ፣ ማስታወሻ ደብተራቸውን ከፍተው እና መምህሩ ያዘዛቸውን ለማድረግ አያውቁም።በውጤቱም, የሙከራው ንድፍ ጥብቅ አልነበረም, እናም የመጽሔቱ ኤዲቶሪያል ዲፓርትመንት ይህን እና ያንን ምስል ለመሥራት እንደሚፈልጉ ተናግሯል, እናም በድንጋጤ ውስጥ አደረጉት.ቅሪተ አካላት የሚሠሩት በዚህ መንገድ ነው!
ወደ ቤት የቀረበ, የሙከራው የመጀመሪያ መርህ መወሰን ነውየሙከራ ሎጂክ ጥብቅነት.በጣም መሠረታዊው ነገር የሙከራ ንድፍ ነው, እና በሙከራ ዲዛይኑ ውስጥ በጣም አስፈላጊው ነገር የታለመውን ናሙና, የማጣቀሻ ናሙና (ቁጥጥር) እና የድግግሞሾችን ብዛት እንዴት ማቀናጀት እንደሚቻል ነው, ስለዚህም የሙከራ መረጃው ሊጣቀስ, ሊወዳደር እና ሊያሳምን ይችላል.
የዒላማው ናሙናከተወሰነ ህክምና በኋላ የዒላማውን ዘረ-መል እንድናገኝ የሚጠይቀንን ናሙና ያመለክታል.የማጣቀሻ ናሙናናሙናው ምንም ዓይነት ህክምና ሳይደረግለት ነው, እሱም ብዙውን ጊዜ በባዮሎጂ የዱር ዓይነት ተብሎ ይጠራል.
የሙከራ ቅጂዎችበጣም አስፈላጊ ናቸው.በአጠቃላይ, የማሳመን ድግግሞሽ ብዛት ከሶስት በላይ መሆን አለበት.ባዮሎጂካል ማባዛት እና ቴክኒካዊ ማባዛት ምን እንደሆነ መለየት ያስፈልጋል.
ባዮሎጂካል ግልባጮች: ተመሳሳይ የማረጋገጫ ሙከራ በተለያዩ ቁሳቁሶች (ጊዜ, ተክሎች, ስብስቦች, የምላሽ ሰሌዳዎች).
ባዮሎጂካል ብዜት
የበርበሬን ፀረ ተባይ መድኃኒት እንደ ምሳሌ እንውሰድ።ፀረ-ተባይ መድሃኒቶችን በኤቢሲ ሶስት እፅዋት ላይ መርጨት እንፈልጋለን, ከዚያም ሦስቱ የኤቢሲ ተክሎች ሶስት ባዮሎጂያዊ ቅጂዎች ናቸው, እና በተለያዩ ቁሳቁሶች የተካሄዱ ተመሳሳይ የማረጋገጫ ሙከራዎች ናቸው.ነገር ግን እንደ ሙከራ በእርግጠኝነት ቁጥጥር ያስፈልጋል, ስለዚህ የእጽዋት A ቅርንጫፎችን አንዱን በመርጨት የሙከራ ቡድን A ለመመስረት እና የቁጥጥር ቡድን ለመመስረት ሌሎቹን የእጽዋት A ቅርንጫፎችን አንረጭም.ለ B እና C ተመሳሳይ ነገር ያድርጉ።
ቴክኒካዊ ቅጂዎች (የቴክኒካል ቅጂዎች): በኦፕራሲዮኑ ምክንያት የሚፈጠሩ ስህተቶችን ለማስወገድ የተነደፈ ተደጋጋሚ ሙከራ ነው, ይህም በእውነቱ ተመሳሳይ ቁሳቁስ ውስጥ የተካተተ የተባዛ ጉድጓድ ነው.ሁለቱም ሕክምናዎች እና መቆጣጠሪያዎች የታለመው ዘረ-መል እና የውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂን የተባዙ መቼቶች (ቢያንስ ሶስት) ሊኖራቸው ይገባል።
ቴክኒካዊ ድግግሞሽ
በፀረ-ተባይ መድሃኒት የታከመውን ፔፐር እንደገና እንደ ምሳሌ እንውሰድ.ለሙከራ ቡድን A፣ ከተለየ በኋላ አማካዩን ለመውሰድ ለታለመው ዘረ-መል እና ለውስጣዊ ማመሳከሪያ ዘረ-መል (ጅን) ሶስት የ PCR ቀዳዳዎችን 1፣ 2 እና 3 አድርገናል።ለእጽዋት ኤ ቁጥጥር ቡድኖች እንዲሁ በተመሳሳይ መንገድ ይያዛሉ.በተመሳሳይ ሁኔታ ለ B እና C ተክሎች ተመሳሳይ ህክምና ያድርጉ.ይህ ቴክኒካዊ ድግግሞሽ ነው.
መሆኑን ልብ ሊባል የሚገባው ጉዳይ ነው።ወደ ስታቲስቲክስ የሚገባው ነገር ባዮሎጂካል ድግግሞሽ ነው, እና ቴክኒካዊ ድግግሞሽ በሙከራ ሂደት ውስጥ ምንም አይነት የዘፈቀደ ክስተቶች መኖራቸውን ለመፈተሽ ነው, ስለዚህም የሙከራ ውጤቶቹ ተዓማኒ እንዲሆኑ, ማለትም, ብዙውን ጊዜ እንደምንለው አማካይቸውን በመውሰድ ስህተቶችን ለማስወገድ ነው.
አሉታዊ ቁጥጥሮች-NTC እና NRT
NTC (የአብነት ቁጥጥር የሌለበት), አብነት የሌለው መቆጣጠሪያ የሙከራ ቁሱ መበከሉን ለማረጋገጥ ይጠቅማል።በአጠቃላይ ውሃ እንደ አብነት ጥቅም ላይ ይውላል.የፍሎረሰንት ምላሽ ካለ, በቤተ ሙከራ ውስጥ የኑክሊክ አሲድ ብክለት መከሰቱን ያመለክታል.
እነዚህ ብክሎች የሚመጡት፡- ንፁህ ያልሆነ ውሃ፣ ውስጣዊ ዲ ኤን ኤን የያዙ ብቁ ያልሆኑ ሪጀንቶች፣ የፕሪመር ብክለት፣ የላብራቶሪ መሳሪያዎች ብክለት፣ የኤሮሶል ብክለት፣ ወዘተ. RNase scavengers እና RNase inhibitors መጠቀም አለባቸው።ለማግኘት በጣም አስቸጋሪው የኤሮሶል ብክለት ነው።አስቡት የእርስዎ ላቦራቶሪ እንደ ጭስ፣ የተለያዩ ኑክሊክ አሲዶች በአየር ላይ ተንጠልጥለዋል።
NRT (ምንም የተገላቢጦሽ ግልባጭ), ቁጥጥር ያለ በግልባጭ ግልባጭ, ያልሆኑ በግልባጭ የተገለበጠ አር ኤን ኤ እንደ አሉታዊ ቁጥጥር ነው, ይህም gDNA ቀሪዎች ቁጥጥር ነው.
የጂን አገላለፅን በሚሰሩበት ጊዜ የ RNA መጠን በተቃራኒው ቅጂ ከተገለበጠ በኋላ የሲዲኤንኤ መጠንን በመለየት ተገኝቷል.አር ኤን ኤ በሚጸዳበት ጊዜ የ gDNA ቅሪት ካለ በሙከራ ውጤቶች ላይ ስህተቶችን ያስከትላል፣ ምክንያቱም የተገኘው ትክክለኛ ውጤቶች gDNA እና cDNA ናቸው።በአጠቃላይ ሲዲ ኤን ኤ ብቻ ሳይሆን በአር ኤን ኤ በሚወጣበት ጊዜ gDNA ሙሉ በሙሉ መወገድ አለበት።
MIQE (2) - የናሙና መረጃ
የናሙና መረጃ እየተባለ የሚጠራው ስለ qPCR ጽሁፍ ስናተም የአንቀጹ አስፈላጊ አካል የሆነውን የናሙናውን መረጃ በግልፅ ማብራራት አለብን ማለት ነው።በተመሳሳይ፣ ናሙናዎችን በምናካሂድበት ጊዜ የናሙናዎቹ ትክክለኛነት ለማረጋገጥ የራሳችንን ክንዋኔዎች መቆጣጠር አለብን።
የናሙና መግለጫው ውጤት ብቻ ነው, እና በሙከራው ጊዜ ለተወሰዱት ቁሳቁሶች የበለጠ ትኩረት መስጠት አለብን.
የሙከራ ቁሳቁሶች ምርጫ
የደም ናሙናዎች - ትኩስ ደም ይምረጡ, ከ 4 ሰዓታት ያልበለጠ.የሕዋስ ናሙናዎች - በጠንካራ የእድገት ጊዜ ውስጥ ትኩስ ሴሎችን ለመሰብሰብ ይምረጡ።የእንስሳት ቲሹ - ትኩስ ፣ በጠንካራ እያደገ የሚሄድ ቲሹን ይምረጡ።የእፅዋት ቲሹ - ትኩስ, ወጣት ቲሹ ይምረጡ.
በእነዚህ ጥቂት ዓረፍተ ነገሮች ውስጥ ቁልፍ ቃል እንዳለ አስተውለህ መሆን አለበት፡ ትኩስ .
ከላይ ለተጠቀሱት ናሙናዎች፣ በገበያ ላይ ያለው ምርጡ፣ ወጪ ቆጣቢ እና የተረጋጋ ኪት የForegene ኪት ነው፣ እሱም በፍጥነት እና በቀላሉ ዲ ኤን ኤ እና አር ኤን ኤ ማውጣት ይችላል።
የእፅዋት ጠቅላላ አር ኤን ኤ ማግለል ኪት ፕላስ
የሙከራ ቁሳቁሶች ማከማቻ
በአጠቃላይ ሁኔታዎች የሚፈቀዱ ከሆነ ናሙናዎችን ማከማቸት አንመክርም።ነገር ግን፣ ከናሙና በኋላ ወዲያውኑ ሙከራዎችን ማድረግ የማይችሉ ብዙ ጓደኞች አሉ፣ እና አንዳንዶቹ ፈሳሽ ናይትሮጅን ታንኮችን ለናሙና ወደ ሜዳ ይዘው መሄድ ያስፈልጋቸዋል።
ለእንደዚህ አይነቱ ታታሪ ጓደኛ ፣የ reagen consumables አልገባህም ማለት እችላለሁ።አሁን ብዙ የሪአጀንት ፍጆታ ኩባንያዎች የአር ኤን ኤ ናሙናዎችን በክፍል ሙቀት ውስጥ ማከማቸት የሚችሉ ሬጀንቶችን ያመርታሉ እና እነሱን ለመጠቀም መምረጥ ይችላሉ።የተለመደው የማከማቻ ዘዴ ፈሳሽ ናይትሮጅን ማከማቻ ነው, ለመሸከም ቀላል የሆነ ትንሽ ፈሳሽ ናይትሮጅን ታንክ በመጠቀም.ናሙናውን ወደ ላቦራቶሪ ካመጡ በኋላ በ -80 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ማቀዝቀዣ ውስጥ ያስቀምጡት.
አር ኤን ለሚያካትቱ ሙከራዎች፣ ባለ ስድስት ቃል መርህ መከተል አለበት፡-ዝቅተኛ የሙቀት መጠን ፣ ኢንዛይሞች የሉም ፣እናፈጣን .
ዝቅተኛ የሙቀት መጠን ጽንሰ-ሐሳብ ለመረዳት ቀላል ነው;ያለ ኢንዛይሞች ፣ RNase በምንኖርበት አለም ውስጥ በሁሉም ቦታ አለ (አለበለዚያ በኤች አይ ቪ ይገደሉ ነበር) ፣ ስለዚህ ሙከራዎችን ሲያደርጉ RNase ን እንዴት ማስወገድ እንደሚቻል በጣም አስፈላጊ ጽንሰ-ሀሳብ ነው ።ፈጣን ፣በአለም ላይ ኩንግ ፉ የለም ሊሰበር የማይችል ፍጥነት ብቻ ነው የማይሰበር.
ስለዚህ, በተወሰነ መልኩ, የማውጫ ጊዜው ባጠረ መጠን, ኪት የተሻለ ይሆናል.ለምን ያደርጋልForegene's Kit ፍጥነትን አጽንዖት ይሰጣሉ፣ ምክንያቱም በደንብ ስለሚያውቁት።
PS: አንዳንድ ልጃገረዶች በጣም በጥንቃቄ ሙከራዎችን ያደርጋሉ, ነገር ግን ከበርካታ አመታት ስራ በኋላ እንደ ሸርተቴ ጥሩ አይደሉም.አምላክ ፍትሐዊ እንዳልሆነ፣ ስለሌሎች እንደሚያማርርና ሕይወት እንደሚፈልግ ይሰማቸዋል።እንደውም አልገባትም።አር ኤን ኤውን በደንብ አልጠበቀውም፣ እና የስላም ዱንክ ተጫዋች ተንኮለኛ ነበር።ሙከራውን ሲያደርግ የሶስት ጊዜ, አምስት ጊዜ እና ሁለት ምድቦችን በማዘጋጀት የሻምበል ዳንኩን እንደሚጨርስ አስቦ ነበር, ነገር ግን ሙከራውን ጥሩ አድርጎታል.
ማስታወሻ: ቀርፋፋ፣ ተጨማሪ የ RNase ወረራ እድሎች።ፈጣን ለመሆን እራስዎን እንዴት ማሰልጠን ይቻላል?ምንም መንገድ የለም, የበለጠ ይለማመዱ.
ለተለያዩ ሙከራዎች እና የተለያዩ ናሙናዎች አሁንም ተጨማሪ ጽሑፎችን ማንበብ እና ለማቀነባበር ተገቢውን ዘዴ መምረጥ ያስፈልጋል.ለናሙና አሰባሰብ እና ለማከማቸት ሂደት MIQE በወረቀቱ ላይ በግልፅ መፃፍ አለበት ስለዚህ ገምጋሚዎቹ የወረቀቱን አስተማማኝነት እንዲገመግሙ እና የተደናገጡ ወጣቶች ሙከራዎን እንዲደግሙም ምቹ ነው።
ባዮሎጂያዊ ሙከራዎች አስቸጋሪ ቢሆኑም ከፍተኛ ደረጃ ያላቸው ናቸው.ካልተጠነቀቅክ አለምን መገልበጥ ትችላለህ።ለምሳሌ SARS ወደ ባዮኬሚካላዊ ቀውስ ማድረግ ወይም 1.3 ቢሊዮን ሰዎችን ለመታደግ የተዳቀለ ሩዝ ማድረግ።ከታች ያለው ምስል የኬሚካላዊ ሙከራ ነው, የእሱን ዲክ መሰል ገጽታ በመመልከት ብቻ በምርምርዎ ምን ያህል እንደሚኮሩ መረዳት አለብዎት.እርሳው፣ አትጠቁሩት።
MIQE (3) - ኑክሊክ አሲድ ማውጣት.
የኑክሊክ አሲድ ማውጣት ትልቅ ክስተት ነው፣ እና ሁሉም የሞለኪውላር ባዮሎጂ ሙከራዎች የሚጀምሩት በኑክሊክ አሲድ ማውጣት ነው።በመጀመሪያ የ MIQE ይዘትን በኒውክሊክ አሲድ ማውጣት ላይ እንገልብጠው።
ይህን ቅጽ ሲመለከቱ, ላይ ላዩን መቆየት አይችሉም.ቅጹ ዶግማ ነው።ከፍተኛ ተማሪ ለመሆን ለምን እንደሆነ መጠየቅ አለቦት።የዚህ ሰንጠረዥ አስፈላጊ ይዘት የሚከተለው ነው: መከታተልየአር ኤን ኤ ንጽህና፣ ታማኝነት፣ ወጥነት እና የማውጣት መጠን .
የመጀመርያው ክፍልሂደት ወይም መሳሪያ ኑክሊክ አሲድ የማውጣት ደረጃ ነው።አውቶማቲክ ኑክሊክ አሲድ ለማውጣት ከተጠቀሙ (የላቀ, እባክዎን ለግዢ አግኙኝ), የመሳሪያውን ሞዴል ስም ማመልከት ያስፈልግዎታል.
የመሳሪያው ስም እና
ለለውጥ ዝርዝሮች ምን ዓይነት ኪት ጥቅም ላይ እንደዋለ፣ ምን ልዩ ሬጀንቶች እንደታከሉ ወይም ምን ልዩ ክንዋኔዎች እንደተደረጉ በግልጽ መገለጽ አለበት ስለዚህ ሌሎች በቀላሉ የእርስዎን ሙከራ እንዲደግሙ።
አንዳንድ ሰዎች ይህ ሚስጥራዊ መሳሪያቸው ነው እና ለሌሎች አይናገሩም ብለው በማሰብ ልዩ ናሙናዎችን ሲያወጡ አንዳንድ ልዩ ሬጀንቶችን ይጨምራሉ።በሚስጥር ሲይዙት ጽሑፍዎን እንዲያንጸባርቁ ለማድረግ ዕድሉን ያጣሉ።ጎበዝ አትሁን በሳይንሳዊ ጥናት ከሀገር ሽማግሌው ዣንግ የበለጠ ታማኝ መሆን አለብህ ብልህ መሆን ከፈለግክ ጽሑፉ ደደብ ያደርግሃል።
የመሳሪያውን የምርት ቁጥር ማስታወስ አለበትኪት ሲያዝዙ እና ጽሑፉን ሲጽፉ .በመሳሪያው ላይ በአጠቃላይ ሁለት ቁጥሮች አሉ: ድመት - ካታሎግ ቁጥር (የምርት ቁጥር, የጽሑፍ ቁጥር), ሎጥ - የምርት ዕጣ ቁጥር (ምርቱ ከየትኛው ስብስብ እንደመጣ ለማመልከት ጥቅም ላይ ይውላል).
በተጨማሪም፣ ባዮኬሚካል ሪጀንቶችን ሲያዝ የCAS ቁጥር ብዙ ጊዜ ጥቅም ላይ ይውላል፣ እና እኔ አንድ ላይ ታዋቂ አደርገዋለሁ።የ CAS ቁጥሩ በአሜሪካ ኬሚካላዊ ማህበር ለእያንዳንዱ አዲስ የኬሚካል መድሃኒት የሚሰጠው ቁጥር ነው።በአጠቃላይ ሶስት ቁጥሮች በአንድ ሰረዝ የተገናኙ ናቸው።የሩሹይ CAS ቁጥር፡ 7732-18-5ኬሚካሎች ብዙ ጊዜ ብዙ ተለዋጭ ስሞች አሏቸው፣ ነገር ግን የ CAS ቁጥር ልዩ ነው።መድሃኒት ሲያዝዙ በመጀመሪያ የ CAS ቁጥሩን ማረጋገጥ ይችላሉ።
ወደ ቤት የቀረበ፣ ለምን እነዚህን ነገሮች በግልፅ መግለጽ አለብን?እንደ እውነቱ ከሆነ, የአር ኤን ኤ ማውጣትን ጥራት ማረጋገጥም ነው.የመሳሪያዎች እና ኪት አጠቃቀም የአር ኤን ኤ ማውጣት የበለጠ ወጥነት ያለው ያደርገዋል።የመደበኛ ላቦራቶሪዎች የማውጣት መጠን ትልቅ አይደለም, እና በኪት ማግኘት ይቻላል.
የDNase ወይም RNase ሕክምና ዝርዝሮች
የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR አስፈላጊ ጉዳይ የዲኤንኤ ብክለትን መከላከል ነው፣ እና ብክለት ካለ ሙከራ አያድርጉ።ስለዚህ, በሙከራ ሂደቱ ውስጥ ያለው ዲ ኤን ኤ ሙሉ በሙሉ እና ሙሉ በሙሉ መወገዱን ለማሳየት ዲ ኤን ኤውን ለማቀነባበር የተጠቀሙበትን ሂደት መግለጽ አስፈላጊ ነው.በንድፍ ንድፍ የተወከለው.
የአር ኤን ኤ እና አር ኤን ኤ ንድፍ
በአጠቃላይ ዲኤንኤ የማስወገድ ዘዴው ከተወሰደ በኋላ አር ኤን ኤ በዲ ኤን ኤ ማከም ነው።ይሁን እንጂ እነዚህ በአንጻራዊ ሁኔታ የቆዩ ዘዴዎች ናቸው.የንግድ አር ኤን ኤ ማውጣት ኪቶች ዲ ኤን ኤስ ሳይጨምሩ በማውጣት ሂደት ውስጥ ዲ ኤን ኤውን ማስወገድ ችለዋል።ለምሳሌ, ተከታታይ ስብስቦች ከ Foregene .
ማስታወሻ: በአር ኤን ኤ መውጣት ወቅት ዲኤንኤን ማስወገድ በጣም አደገኛ ባለ ሁለት አፍ ጎራዴ ነው, ይህም የአር ኤን ኤ ማውጣትን ጊዜ ያራዝመዋል እና የአር ኤን ኤ የመበላሸት አደጋን ይጨምራል.በመሠረቱ, በአር ኤን ኤ ምርት እና በንጽህና መካከል የሚደረግ የንግድ ልውውጥ ነው.
በተጨማሪም, በሲሊካ ላይ የተመሰረተ የማስታወቂያ አምድ ላይ የተጨመረው የዲ ኤንኤዝ መጠን በጣም ትንሽ ነው, እና ውጤቱን ለማግኘት ከፍተኛ ጥራት ያለው ዲ ኤንኤስ ጥቅም ላይ መዋል አለበት.ያልተመቻቸ ዲኤንኤሴ በፍጥነት እና ሙሉ በሙሉ መፈጨት አይችልም።ይህ የነጋዴውን የቴክኒክ ደረጃ ፈተና ነው።እርግጥ ነው፣ ዲ ኤን ኤ ያለ ዲ ኤንኤስ ሊወገድ ይችላል ብለው የሚፎክሩ ብዙ እንግዳ ነጋዴዎች አሉ።ዲኤንኤ ያለ ዲ ኤንኤስ ሙሉ በሙሉ ይወገዳል ብሎ የሚፎክር ሁሉ ሆሊጋን ነው ማለት ይቻላል።ዲ ኤን ኤ በአንፃራዊነት የተረጋጋ ባለ ሁለት ገመድ መዋቅር ነው, እና በመነጋገር እና በመሳቅ ብቻ ሊጠፋ አይችልም.
የብክለት ግምገማ
የግምገማ ዘዴ፡ ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ማወቂያ፣ 1% አጋሮዝ፣ 6V/ሴሜ፣ 15ደቂቃ፣ ጭነት 1-3 ul
ኑክሊክ አሲድ መጠናዊ ትንተና
ብዙውን ጊዜ የሚለካው UV spectrophotometer በመጠቀም ነው።በመጀመሪያ የሦስቱን የ OD260፣ OD280 እና OD230 እሴቶች ፍቺን ላስተዋውቅ።
· OD260nm: ከፍተኛው የኑክሊክ አሲድ የመጠጫ ጫፍ የመጠጫ ሞገድ ርዝመት ሲሆን በጣም ጥሩው የሚለካው እሴት ከ0.1 እስከ 1.0 ይደርሳል።ካልሆነ፣ ናሙናውን ወደ ክልል ውስጥ ለማምጣት ይቀልጡት ወይም ያተኩሩ።
· OD280nm: ከፍተኛውን የፕሮቲን እና የ phenolic ንጥረ ነገሮች የመጠጫ ሞገድ ርዝመት ነው።
· OD230nm: ከፍተኛው የካርቦሃይድሬትስ ከፍተኛ የመጠጫ ጫፍ የመምጠጥ የሞገድ ርዝመት ነው።
በመቀጠል ስለ እያንዳንዱ አመላካች ሚና እንነጋገር.ለ A260, የኒውክሊክ አሲድ ምርትን ለመለካት ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.መቼ OD260=1፣ dsDNA=50μg/ml፣ ssDNA=37μg/ml፣ RNA=40μg/ml
ለንፅህና፣ በተለምዶ የምናያቸው ሬሾዎችን መመልከት አለብን፡ OD260/280 እና OD260/230።
· ንጹህ ዲ ኤን ኤ፡ OD260/280 በግምት ከ1.8 ጋር እኩል ነው።ከ 1.9 በላይ ሲሆን, የአር ኤን ኤ ብክለት መኖሩን ያሳያል, እና ከ 1.6 በታች ከሆነ, የፕሮቲን እና የ phenol ብክለት መኖሩን ያመለክታል.
· ንጹህ አር ኤን ኤ፡ 1.7
· OD260/230፡ ዲኤንኤ ወይም አር ኤን ኤ ቢሆን፣ የማመሳከሪያ ዋጋው 2.5 ነው።ከ 2.0 በታች በሚሆንበት ጊዜ የስኳር, የጨው እና የኦርጋኒክ ቁስ ብክለት መኖሩን ያመለክታል.
አር ኤን ኤ ትክክለኛነት
የ RNA ትክክለኛነትን ለመለካት በጣም አስፈላጊ ነው.በአጠቃላይ በ28S እና 18S አር ኤን ኤ መካከል ያለው ብሩህነት የሁለት እጥፍ ግንኙነት መሆኑን ለማረጋገጥ የ RNA denaturation gel ሙከራ ማድረግ አስፈላጊ ነው።ሶስተኛው ባንድ 5S ሲወጣ አር ኤን ኤው ማሽቆልቆል ጀምሯል ማለት ነው፣ ከተገላቢጦሽ በስተቀር።
ለአር ኤን ኤ ጥራት ምዘና መረጃ፡- ከላይ ከተጠቀሱት ሙከራዎች በተጨማሪ ከአር ኤን ኤ ኢንተግሪቲ አንጻር አንዳንድ የላቁ የመሳሪያ ሙከራዎችም አሉ ለምሳሌ የኤክስፐርዮን አውቶማቲክ ኤሌክትሮፎረሲስ ሲስተም የ RQI ኢንተግሪቲቲ ሙከራ አር ኤን ኤ በማይታይ ሁኔታ መበላሸቱን ማወቅ ይችላል።
በሳይንሳዊ ምርምር ውስጥ, የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR በታለመው ጂን እና በውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂን መካከል ያለው ንፅፅር ነው.ስለዚህ, በአር ኤን ኤ ናሙና ማቆየት, አር ኤን ኤ ማውጣት, ወዘተ., ዋናው ግብ የአር ኤን ኤውን ትክክለኛነት ማረጋገጥ ነው.
የአር ኤን ኤ ትክክለኛነት በታለመው ዘረ-መል እና በውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂን መካከል ያለውን ሚዛን እንዴት እንደሚነካው ከታች ካለው ምስል በቀላሉ መረዳት ይቻላል።ማሽቆልቆል ወደ ዘረ-መል (ጅን) አለመሟላት ያስከትላል, የውስጥ የማጣቀሻ ጂን አለመሟላት ወይም የታለመው ጂን አለመሟላት, በመረጃው ላይ ትልቅ ተጽእኖ ይኖረዋል.
የዒላማ ዘረ-መል (ጅን) እና የማጣቀሻ ዘረ-መል (ጅን) ንድፍ፣ እውነት መሆን የለበትም
የእገዳ ሙከራ (የሲቲ እሴቱ በከፍተኛ ወይም ዝቅተኛ ትኩረት ወይም ሌሎች ሁኔታዎች የታፈነ መሆኑን)
ይህንን ምስል እንደ ምሳሌ በመውሰድ የአምስቱ ኩርባዎች የሲቲ እሴቶች እንደሚከተለው ናቸው.በኩርባዎቹ መካከል ያለው የሲቲ እሴቶች ስርጭት ያልተመጣጠነ ነው, እና የሲቲ እሴቶች በከፍተኛ እና ዝቅተኛ ስብስቦች ውስጥ ዘግይተዋል, ይህም የ PCR እገዳ ነው.
ቁልፍ ነጥብ፡- በአር ኤን ኤ ማውጣት ሂደት ውስጥ የተሳሳቱ አመለካከቶችን ትተን ትክክለኛዎቹን መመስረት አለብን።
የተሳሳተው ሀሳብ፡ አር ኤን ኤን ማውጣት ምርጡን ብቻ ነው የሚከታተለው፣ የተገኘው የአር ኤን ኤ መጠን በጨመረ መጠን የተሻለ እንደሚሆን በማሰብ ነው።እንደ እውነቱ ከሆነ የቁጥር መጠንን በምናደርግበት ጊዜ የጂኖች ቁጥር በጣም ትልቅ ካልሆነ ብዙ አር ኤን ኤ አያስፈልገንም.የምታወጣው አር ኤን ኤ መጠን ከበቂ በላይ ነው።
ትክክለኛው ጽንሰ-ሐሳብ የሚከተለው ነው-አር ኤን ኤ ማውጣት ንጽህናን, ታማኝነትን እና ወጥነትን መከተል አለበት.ንፅህና የሚቀጥለው የተገላቢጦሽ ግልባጭ እንዳልተከለከለ እና ውሂቡ በዲ ኤን ኤ ላይ ተጽዕኖ እንደማይኖረው ማረጋገጥ ይችላል።ታማኝነት የዒላማ ቅደም ተከተሎችን እና የውስጥ ማጣቀሻዎችን ሚዛን ያረጋግጣል.ወጥነት የተረጋጋ ናሙና መጫንን ያረጋግጣል.
MIQE (4) - የተገላቢጦሽ ግልባጭ
የተሳሳተ ግንዛቤከፍተኛ የናሙና መጠን ማሳደድ።
ትክክለኛ ጽንሰ-ሐሳብ: ወጥነት (መረጋጋት)፣ የተጫነው አር ኤን ኤ መጠን ምንም ይሁን ምን፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍና ወጥነት ያለው ሆኖ ይቆያል፣ ይህም በ cDNA ውስጥ ያሉ ልዩነቶች የኤምአርኤን ልዩነቶችን በትክክል ሊያንፀባርቁ እንደሚችሉ ያረጋግጣል።
ይህንን ሂደት በንድፍ ንድፍ እናብራራለን-
የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍና ሥዕላዊ መግለጫ፣ እውነት አትሁን
በመጀመሪያ ደረጃ, በተገላቢጦሽ የመገልበጥ ሂደት እና በ PCR ሂደት መካከል ያለውን ልዩነት መረዳት አለብን.PCR ብዙ የማሞቅ እና የማለስለስ ሂደቶችን ያካሂዳል, እና የታለመው ቁራጭ በከፍተኛ ሁኔታ ያድጋል;የተገላቢጦሽ ግልባጭ ይህ ሂደት ባይኖረውም ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ በእውነቱ አንድ ለአንድ እንደሆነ መገመት እንችላለን በማባዛት ሂደት ውስጥ ፣ እንደ ብዙ የ RNA ቁርጥራጮች።
ብዙ የሲዲኤን መረጃ ሊያገኙ ስለሚችሉ፣ አሁን ሊረዱት ይገባል፣ ምክንያቱም ትላልቅ እና ትናንሽ ቁርጥራጮች ወደ ተቃራኒው የተገለበጡ ናቸው እና በአንድ ቁራጭ ላይ ማተኮር አይቻልም።እና የአር ኤን ኤ መጠን በአንፃራዊነት ትንሽ ስለሆነ፣ የተገኘው የሲዲኤንኤ መጠንም በአንጻራዊ ሁኔታ ትንሽ ነው፣ እንደ PCR ሳይሆን፣ የማጉላት ውጤት አለው፣ ስለዚህም በመሠረቱ መለየት አይቻልም።
የሲዲኤንኤ ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ውጤቶች
በሁለተኛ ደረጃ ፣ በሐሳብ ደረጃ ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ አንድ ለአንድ ነው የሚከናወነው ፣ ግን ከማንኛውም ኩባንያ የተገላቢጦሽ ጽሑፍ ይህንን ውጤት ሊያመጣ አይችልም።በመሠረቱ፣ የብዙዎቹ የተገላቢጦሽ ግልባጮች ውጤታማነት ከ30-50% መካከል ይቅበዘበዛል።ጉዳዩ ይህ ከሆነ፣ በአንፃራዊነት የተረጋጋ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍና እንዲኖረን እንመርጣለን፣ ይህም በሥዕሉ ላይ ማየት የምንፈልገው፡ 3 አር ኤን ኤ 2 ሲዲኤንኤ፣ 6 አር ኤን ኤዎች 4 ሲዲኤንኤ ያገኛሉ፣ ስለዚህ ምንም ያህል ናሙና ቢጫን፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ውጤታማነት በአንጻራዊነት የተረጋጋ ነው።የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍና ያልተረጋጋ እና ከፍተኛ ትኩረት የተከለከሉበትን ሁኔታ ማየት አንፈልግም።
ስለዚህ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍና የተረጋጋ መሆኑን እንዴት ማረጋገጥ ይቻላል?ዘዴው በጣም ቀላል ነው፣ የንፅፅር ሙከራ ብቻ ነው የሚፈለገው፡ አንደኛው የአር ኤን ኤውን በእጥፍ ከተጨመረ በኋላ ወደ ሲዲ ኤን ኤ መገልበጥ ሲሆን ሁለተኛው ደግሞ በተቃራኒው ወደ ሲዲኤን ከተገለበጡ በኋላ በእጥፍ ማራዘሚያ ማድረግ እና ከዚያ የተገኘውን ቁልቁል ለማየት qPCR ን ያድርጉ ወጥነት ያለው ነው ።እንደ ከፍተኛ ተማሪ በሰከንዶች ውስጥ ሊረዱት ይገባል.ከታች እንደሚታየው፡-
የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍና የተረጋጋ መሆኑን ለመፈተሽ የአር ኤን ኤ እና ሲዲኤን ማቅለጥ
ገለባ ግልባጭ እና ኪት
ፍፁም የፍሎረሰንት አሃዛዊ PCR እንዴት በጣም ጥሩ የተገላቢጦሽ ግልባጭ እና ኪት ሊኖረው ይችላል።የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴስ እንደ ምንጩ፣ AMV ወይምኤም-ኤም.ኤል.ቪ, እና አፈፃፀማቸው በሠንጠረዥ ውስጥ ከሚታየው ጋር ተመሳሳይ ነው.
RNase H እንቅስቃሴ
RNase H Ribonuclease H ነው, የቻይናው ስም ribonuclease H ነው, እሱም በዲ ኤን ኤ-ኤን ኤ ዲቃላ ሰንሰለት ውስጥ አር ኤን ኤ ሃይድሮላይዝ ማድረግ የሚችል endoribonuclease ነው.RNase H የፎስፎዲስተር ቦንዶችን በነጠላ-ፈትል ወይም ባለ ሁለት-ክር ዲ ኤን ኤ ወይም አር ኤን ኤ ውስጥ ሃይድሮላይዝ ማድረግ አይችልም፣ ማለትም፣ ነጠላ ወይም ባለ ሁለት ገመድ ዲ ኤን ኤ ወይም አር ኤን ኤ ሊፈጭ አይችልም።በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለው በሲዲኤንኤ ሁለተኛ ፈትል ውህደት ውስጥ ነው።
እንግዳ ነገር ነው።እኛ የምንለው የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት የ RNase H እንቅስቃሴ ነው እንጂ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ RNase H ይዟል ማለት አይደለም፣ እና RNase Hን ከተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴ መለየት ላይቻል ይችላል፣ ምናልባትም የተወሰኑ ቡድኖች በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴ ውስጥ በመምጣታቸው ይህ እንቅስቃሴ የተከሰተው በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴ ነው።
ስለዚህ የAMV ከፍተኛ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍና ምንም ይሁን ምን የ RNase H እንቅስቃሴው የሲዲኤንኤ ምርትን ይቀንሳል።እርግጥ ነው፣ የሪኤጀንት አምራቾች በተቻለ መጠን የሲዲኤንኤ ምርትን ለመጨመር የ RNase H እንቅስቃሴን በግልባጭ ትራንስክሪፕት ለማስወገድ ምርቶቻቸውን በየጊዜው እያመቻቹ ነው።
የሚያበሳጭ ሙቀት
በተለያየ የሙቀት መጠን ውስጥ የ RNA ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር
በተለያየ የሙቀት መጠን ለሁለተኛ ደረጃ የአር ኤን ኤ አወቃቀር ከላይ ያለውን ምስል ይመልከቱ እና በተወሰነ የሙቀት መጠን እና የጨው ክምችት ሁኔታዎች ውስጥ የታለመውን ክፍልፋይ ሁለተኛ ደረጃ ለመወሰን mFold የመስመር ላይ መሣሪያን ይጠቀሙ።በ 55 ° ሴ, የአር ኤን ኤ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር አሁንም በጣም የተወሳሰበ ነው, የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት ሊሠራ አይችልም, እና የሁለተኛው መዋቅር እስከ 65 ° ሴ ድረስ ሙሉ በሙሉ ሊፈታ አይችልም, የ AMV እና M-MLV ምርጥ የሙቀት መጠን ከዚህ የሙቀት መጠን በጣም ያነሰ ነው.
ምን ለማድረግየሁለተኛ ደረጃ መዋቅሩ የአብነት በራሱ ማሟያ ማጣመር ሲሆን ይህም በፕሪመር እና በግልባጭ ትራንስክሪፕት እና በአብነት መካከል ጠንካራ ፉክክር እንዲኖር ያደርጋል፣ ይህም እንደ ዝቅተኛ ኢ እና ደካማ ተደጋጋሚነት ያሉ ተከታታይ ችግሮች ያስከትላል።
ምን ለማድረግበተቻለ መጠን የመረበሽ ሙቀትን ብቻ ይጨምሩ.
ብዙ ሬጀንት አምራቾች የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት በጄኔቲክ ምህንድስና እያሻሻሉ ነው።አንዳንዶቹ እንደ ጂፋን እና አይዴላይ ያሉ የምላሽ ሙቀት ይጨምራሉ፣ እና አንዳንዶች በኤንዛይሙ እና በአር ኤን ኤ አብነት መካከል ያለውን ዝምድና ለማሻሻል የ RNase H ኢንዛይም ቡድንን ያስወግዳሉ።ከፍተኛ ቁርኝት የሁለተኛውን መዋቅር በውድድር በመጭመቅ እና በተረጋጋ ሁኔታ ማንበብ እና እንዲሁም የተገላቢጦሽ ጽሑፍን ውጤታማነት በእጅጉ ያሻሽላል።
ቁልፍ ነጥብ፡ የተገላቢጦሽ ግልባጭ የበለጠ አስፈላጊ ነው የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍናን (ኢንዛይሞች ቀልጣፋ ብቻ ሳይሆን የተረጋጋ መሆን አለባቸው) ከተጫነው የናሙና መጠን ይልቅ፣ በተለይ ትልቅ መጠን ያለው የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ካልሆነ በጭራሽ አይቻልም።በርካታ ሲዲኤንኤዎች።
የተለያዩ አምራቾችም ወጥነትን ለመፈለግ አንዳንድ ጥረቶችን አድርገዋል.ለምሳሌ፣ አብዛኞቹ ኩባንያዎች አሁን የተገላቢጦሽ ጽሑፍን እንደ መደበኛ ኪት ለሽያጭ አዘጋጅተዋል፣ ይህ ጥሩ ምርጫ ነው።
ለምሳሌ፣ Foregene's RT Easy Series Kits፡-
RT Easy I (ማስተር ፕሪሚክስ ለመጀመሪያው ሲዲኤንኤ ውህደት ኪት)
MIQE (5) - የታለመ የጂን መረጃ
ከላይ ያለው ምስል ያብራራል
1. ይህ ዘረ-መል ለተደጋጋሚ ሙከራዎች ውጤታማ መሆን አለመሆኑ በአጠቃላይ በተደጋጋሚ ሙከራዎች ሊረጋገጥ ይችላል።
2. የጂን መታወቂያ, ታውቃለህ.
3. የጂን ርዝመት, የታለመው ጂን አጠቃላይ ርዝመት በእርግጠኝነት ምንም ችግር የለበትም.ፕሪመርን በሚሰሩበት ጊዜ የተሻለ የማጉላት ብቃትን ለማረጋገጥ የአምፕሊኮን ርዝመት ከ80-200ቢፒ መካከል መሆኑን ያረጋግጡ።
4. የተከታታይ ፍንዳታ ንጽጽር መረጃ፣ ልዩ ያልሆነ ማጉላትን ለመከላከል የታለመው ጂን በጂን ባንክ ውስጥ ማነፃፀር አለበት።
5. pseudogenes መገኘት.ፕሴዩዶጂን ከተለመደው ጂን ጋር ተመሳሳይ የሆነ የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተል ነው ነገር ግን መደበኛ ተግባሩን ያጣል።ብዙ ጊዜ በ eukaryotes ባለ ብዙ ጂን ቤተሰብ ውስጥ ይኖራል።ብዙውን ጊዜ በ ψ ይወከላል.ከኮዲንግ ጂን ቅደም ተከተል ጋር በጣም ተመሳሳይ የሆነ በጂኖም ውስጥ የማይሰራ የጂኖም ዲ ኤን ኤ ቅጂ ነው., በአጠቃላይ አልተገለበጡም, እና ምንም ግልጽ ፊዚዮሎጂያዊ ትርጉም የላቸውም.
6. ከ exons እና introns አንጻር የፕሪመርስ አቀማመጥ.በመጀመሪያዎቹ ዓመታት፣ የዲኤንኤ ብክለትን ችግር ስንፈታ፣ ብዙ ጊዜ ለፕሪመርሮች፣ ኤክሰኖች እና ኢንትሮኖች አቀማመጥ ትኩረት እንሰጥ ነበር፣ እና በአጠቃላይ የዲኤንኤ ማጉላትን ለማስወገድ በመግቢያዎች ላይ ፕሪመር ለመንደፍ እናስብ ነበር።እባኮትን ከታች ያለውን ምስል ይመልከቱ፡ ጥቁር ኢንትሮንስን ይወክላል፡ የተለያዩ ሰማያዊዎቹ ኤክሰኖችን ይወክላሉ፡ ሮዝ የጋራ ፕሪመርን ይወክላል እና ደማቅ ቀይ ውስጠ-ስፓን ፕሪመርን ይወክላል።
መርሐግብር ፣ በጭራሽ እውነት
ይህ እንዴት ያለ ፍጹም እቅድ ይመስላል, ግን በእውነቱ, በአብዛኛዎቹ ሁኔታዎች, ትራንስ-ኢንትሮን ፕሪመርሮች እንደታሰበው አስማታዊ አይደሉም, እና ልዩ ያልሆነ ማጉላትንም ያስከትላሉ.ስለዚህ የዲኤንኤ ብክለትን ለመከላከል ከሁሉ የተሻለው መንገድ ዲኤንኤን ሙሉ በሙሉ ማስወገድ ነው.
7. የኮንፎርሜሽን ትንበያ.ይህንን ምሳሌ እንደገና በመጠቀም፣ በተወሰነ የሙቀት መጠን እና የጨው ክምችት ላይ ያለውን የዒላማ ክፍልፋይ ሁለተኛ መዋቅር ለመወሰን mFold የመስመር ላይ መሣሪያን ይጠቀሙ።
በተለያየ የሙቀት መጠን ውስጥ የ RNA ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር
የሁለተኛ ደረጃ መዋቅሩ የአብነት ተጓዳኝ ማጣመር ሲሆን ይህም በፕሪመር እና በአብነት ማጣመር መካከል ጠንካራ ፉክክር እንዲኖር ያደርጋል እና የፕሪመር ትስስር እድሉ አነስተኛ ነው ፣ ይህም እንደ ዝቅተኛ ኢ እና ደካማ ተደጋጋሚነት ያሉ ተከታታይ ችግሮች ያስከትላል።በሶፍትዌር ትንበያ, ሁለተኛ ደረጃ የመዋቅር ችግር ከሌለ, ያ በጣም ጥሩ ይሆናል.ካለ, ተከታዩ ጽሑፋችን በተለይ ይህንን ችግር እንዴት እንደሚፈታ ያብራራል.
MIQE (6) -qPCR ኦሊጎኑክሊዮታይድ
ለ fluorescent quantitative PCR, በየቀኑ የሚታገሉት የመጀመሪያው ነገር አር ኤን ኤ ማውጣት ነው, እና ሁለተኛው ነገር የፕሪመር ንድፍ ሊሆን ይችላል.
በመጀመሪያ ደረጃ, አሁንም በ MIQE የማረጋገጫ ዝርዝር መሰረት ስለ ፕሪመር ዲዛይን ደንቦችን እንፈትሻለን.በጣም ቀላል ከመሆኑ የተነሳ አጭበርባሪዎቹ ሊሳቁ ይችላሉ, እና በአንድ ዓረፍተ ነገር ልንጨርሰው እንችላለን-የፕሪመር ምርመራውን ቅደም ተከተል እና አቀማመጥ እና የማሻሻያ ዘዴን ይፈልጉ.ለፕሪመር የመንጻት ዘዴ, የፕሪመር ውህደት በአሁኑ ጊዜ በጣም ርካሽ ነው, qPCR ለ PAGE እና ከዚያ በላይ የመንጻት ዘዴዎች ብቁ ነው, እና የመዋሃድ መሳሪያው መረጃ አስፈላጊ አይደለም.ብዙ ሰዎች ለብዙ አሥርተ ዓመታት ፕሪመርን ሲሠሩ ቆይተዋል እና አቀናባሪው ABI3900 መሆኑን አያውቁም።
የፕሪመር ዲዛይን መርሆዎችን በሚመለከት በሮት እነሱን ማስታወስ አይጠበቅብዎትም ፣ ምክንያቱም አብዛኛዎቹ የፕሪመር ዲዛይን ሶፍትዌር ወይም የመስመር ላይ መሳሪያዎች እነዚህን ችግሮች (የሚመከር የመስመር ላይ መሣሪያ primer3.ut.ee/) እና 99.999% የፕሪመር ዲዛይን በእጅ አልተሰራም ፣ ይመልከቱ ፣ ደራሲው አንዳንድ ጊዜ በቀን በመቶዎች የሚቆጠሩ ፕሪመርዎችን ይቀይሳል ፣ አንድ በአንድ ካነበቡ ፣ ይሆናል ።
ፕሪመርሮች ከተነደፉ በኋላ የሚከተሉትን ነጥቦች ብቻ ያረጋግጡ።
1. የዲዛይነር ፕሪመር ለ 3′ ፍጻሜ፡- ኦሊጎ ዲቲ ፕሪመርን ለሲዲኤንኤ የመጀመሪያ ስትራንድ ውህድ ለመጠቀም፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍናን እና የአር ኤን ኤ ታማኝነትን ከግምት ውስጥ በማስገባት የማጉላት ቅልጥፍናን ለማሻሻል የተነደፉት ፕሪመርዎች ከ 3′ ጫፍ አጠገብ መቅረጽ አለባቸው።እንደሚከተለው ለማብራራት ፎቶ ይጠቀሙ (ይህን ለመረዳት ምንም መንገድ የለም)
ፕሪምፖች ለምን ወደ 3′ መጨረሻ መቅረጽ አለባቸው፣ እውነት መሆን የለበትም
2. TM ዋጋ፡ የቲኤም ዋጋ በ55-65°C (ምክንያቱም የኤክሶኑክለስ እንቅስቃሴ ከፍተኛው በ60°C) ሲሆን የጂሲ ይዘቱ ከ40%-60% ነው።
3. ፍንዳታ፡- ልዩ ያልሆነ የጂኖም ማጉላትን ለማስወገድ፣ Blast ለተጨማሪ ማረጋገጫ ጥቅም ላይ መዋል አለበት።
MIQE(7)-qPCR ሂደት
1. qPCR ኪት
MIQE መስፈርቶች መሠረት, እኛ በግልጽ PCR ምላሽ ሥርዓት ውቅር ጨምሮ አንቀጽ ውስጥ ሙሉ ምላሽ ሁኔታዎች መግለጽ አለብን, ምን ኪት ጥቅም ላይ ይውላል, አምራቹ, ምን ያህል ትልቅ ምላሽ ሥርዓት, ማቅለሚያ ዘዴ ወይም መጠይቅን ዘዴ ጥቅም ላይ እንደሆነ, PCR ፕሮግራም ቅንብሮች.አንጋፋ አሽከርካሪዎች ኪቱ እስከተመረጠ ድረስ፣ ከላይ ያለው መረጃ በመሠረቱ ይወሰናል።
በአሁኑ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ኪት ማምረት እና ማምረት በጣም የበሰለ ቴክኖሎጂ ነው።በጣም መጥፎ አምራቾችን እስካልመረጡ ድረስ የችግሮች እድላቸው ከፍተኛ አይደለም ነገርግን አሁንም ጥቂት ነጥቦችን ለእርስዎ ልናካፍልዎ እንፈልጋለን።
ትኩስ ጅምር Taq ኢንዛይም፡-በጣም አስፈላጊው የ PCR ክፍል ትኩስ ጅምር Taq ኢንዛይም ነው።በገበያ ላይ ያሉ ትኩስ ጅምር ኢንዛይሞች በአጠቃላይ በሁለት ይከፈላሉ አንደኛው በኬሚካል የተሻሻለ ትኩስ ጅምር ኢንዛይም ነው (እንደ ፓራፊን መክተቻ አድርገው ሊገምቱት ይችላሉ) እና ሌላኛው ለፀረ-ሰው ማሻሻያ (አንቲጂን-አንቲቦዲ ማሰሪያ) ነው።ኬሚካዊ ማሻሻያ ሞቃት ጅምር ኢንዛይሞች የመጀመሪያ መንገድ ነው።የተወሰነ የሙቀት መጠን ሲደርስ ኢንዛይሙ እንቅስቃሴውን ይለቃል.ፀረ-ሰው-የተሻሻለው ትኩስ ጅምር ኢንዛይም የኢንዛይም እንቅስቃሴን ለመግታት ባዮሎጂያዊ ዘዴዎችን ይጠቀማል።የተወሰነ የሙቀት መጠን ሲደርስ ፀረ እንግዳው አካል ይወገዳል እና እንደ ፕሮቲን እንዲነቃ ይደረጋል, እና የኢንዛይም እንቅስቃሴ ወደ ውስጥ ይገባል.
ይሁን እንጂ ይህ ምን ጥቅም አለው?ጉዳዩ ይህ ነው፣ ፀረ-ሰው-የተሻሻሉ ኢንዛይሞች የሚለቀቁት እንቅስቃሴ በኬሚካላዊ መልኩ ከተሻሻሉ ኢንዛይሞች የበለጠ ፈጣን ነው።ካለ ይህ የአምራች ቴክኖሎጂ አሁንም በሺህ ዓመቱ ዘመን ላይ ተጣብቋል።
የማግኒዥየም ion ትኩረት;በ PCR ምላሽ ውስጥ የማግኒዚየም ion ትኩረት በጣም አስፈላጊ ነው.ተገቢው የማግኒዚየም ion ትኩረት የ Taq ኢንዛይም እንቅስቃሴ እንዲለቀቅ ሊያደርግ ይችላል.ትኩረቱ በጣም ዝቅተኛ ከሆነ የኢንዛይም እንቅስቃሴ በከፍተኛ ሁኔታ ይቀንሳል;ትኩረቱ በጣም ከፍተኛ ከሆነ፣ ኢንዛይም-ካታላይዝድ ልዩ ያልሆነ ማጉላት ይሻሻላል።የማግኒዚየም ionዎች ክምችት የፕሪመርሮችን መቀልበስ፣ የአብነት እና የ PCR ምርቶች መቅለጥ የሙቀት መጠን ላይ ተጽእኖ ይኖረዋል፣ በዚህም የተጨመሩ ቁርጥራጮችን ይጎዳል።የማግኒዚየም ions ክምችት በአጠቃላይ በ 25 ሚሜ ቁጥጥር ይደረግበታል.እርግጥ ነው, ለጥሩ ኪት, የማግኒዚየም ionዎች ክምችት በደንብ መቆጣጠር አለበት.አንዳንድ ነጋዴዎች የማግኒዚየም ion ቺሊንግ ኤጀንት ወደ ሬጀንቱ ይጨምራሉ፣ ይህም የማግኒዚየም ion ትኩረትን በራስ-ሰር ማስተካከል የሚያስከትለውን ውጤት ሊያሳካ ይችላል።
የፍሎረሰንት ቀለም ትኩረት;ብዙውን ጊዜ የምንጠቀመው SYBR አረንጓዴ የሆነው የፍሎረሰንት ቀለም በዋናነት ከትንሽ የዲ ኤን ኤው ትንሽ ጎድጎድ ጋር በማያያዝ ፍሎረሰንት ይፈጥራል።
PS: በብርሃን-ስሜታዊ ባህሪያት ምክንያት, በገበያ ላይ ያሉ ምርቶች በአጠቃላይ በቡናማ ግልጽ ያልሆነ የሴንትሪፉጅ ቱቦዎች (ከታች ባለው ስእል እንደሚታየው) የታሸጉ ናቸው.ሆኖም, ይህ ችግር ያጋጥመዋል.ናሙና በሚወሰድበት ጊዜ ፈሳሹ ይጠባ እንደሆነ ለማየት አስቸጋሪ ነው.በዚህ ረገድ, Qingke በእርግጥ በጣም ለተጠቃሚ ምቹ ነው (ከታች በምስሉ ላይ እንደሚታየው), እና ገላጭ ቱቦው ግልጽ ባልሆነ ቆርቆሮ ቦርሳ ውስጥ ተጭኗል.ከዚያም ብርሃንን እና ናሙናዎችን ለማስወገድ ያለውን ምቾት ግምት ውስጥ በማስገባት በቆርቆሮ ቦርሳ ውስጥ ያስቀምጡት.ትክክለኛውን የምርት ቁጥር መምረጥ አለብዎት.TSE204 እጅግ በጣም ወጪ ቆጣቢ ሕልውና ነው፣ ይህም ሣር ለመትከል እንድፈልግ አድርጎኛል።
የፍሎረሰንት ቀለም ትኩረትም በጣም አስፈላጊ ነው.ትኩረቱ በጣም ዝቅተኛ ከሆነ, የማጉላት ኩርባው በኋለኛው ደረጃ ላይ አይወጣም እና ፍጹም አይደለም;ትኩረቱ በጣም ከፍተኛ ከሆነ የድምፅ ጣልቃገብነት ያስከትላል.የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR በዋናነት በሲቲ እሴት ላይ የተመሰረተ ስለሆነ የፍሎረሰንት ቀለም ትኩረት በትክክል ካልተስተካከለ ዝቅተኛው ነጥብ ከከፍተኛው ነጥብ ይሻላል.እርግጥ ነው, ትክክለኛው የቀለም ክምችት በጣም ጥሩ ነው.
ሮክስየ ROX ማቅለሚያዎች በደንብ በደንብ የፍሎረሰንት ምልክት ስህተቶችን ለማስተካከል ያገለግላሉ።አንዳንድ የመሣሪያዎች አምራቾች መለኪያ ያስፈልጋቸዋል, ሌሎች ግን አያስፈልጉም.ለምሳሌ፣ Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR ማጉያ መሳሪያን መጠቀም 7300፣ 7500፣ 7500Fast፣ StepOnePlus እና የመሳሰሉትን ጨምሮ ካሊብሬሽን ይፈልጋል። የአጠቃላይ ኪት መመሪያዎች ይገልፃሉ።
Foregene's qPCR Mix በተለያዩ ሞዴሎች ውስጥ ለመጠቀም ምቹ የሆነውን የ ROX ማቅለሚያም ይዟል።
ደካማ የሃይድሮጂን ትስስር ሕክምናደካማ የሃይድሮጂን ቦንዶች አያያዝ በአንጻራዊነት ቴክኒካዊ ጉዳይ ነው.የብዙ ኪት ማኑዋሎችን ያነበበ ምንም ነገር የለም፣ ግን አንዳቸውም ይህንን ርዕስ አልጠቀሱም።እንደ እውነቱ ከሆነ, በጣም አስፈላጊ ነው.የመሠረቶቹ ጥምረት በዋናነት በሃይድሮጂን ቦንዶች ጥንካሬ ላይ የተመሰረተ ነው.ጠንካራ የሃይድሮጂን ቦንዶች መደበኛ ማጉላት ናቸው ፣ እና ደካማ የሃይድሮጂን ቦንዶች ወደ ልዩ ያልሆነ ማጉላት ይመራሉ ።ደካማ የሃይድሮጂን ቦንዶች በደንብ ሊወገዱ የማይችሉ ከሆነ, ልዩ ያልሆነ ማጉላትን ማስወገድ አይቻልም.በደራሲው ወሰን ውስጥ, ይህንን ችግር ያስተዋሉት ጥቂት ኩባንያዎች ብቻ ናቸው.እቃውን ሲገዙ, ለመምረጥ ለሚፈልጉት ኪት በዚህ ረገድ መፍትሄን ከግምት ውስጥ ማስገባትዎን ማወቅ ይችላሉ.
ምላሽ መጠንየ 20-50ul ስርዓት በብዛት ጥቅም ላይ ይውላል, እና ትናንሽ ጥራዞች ስህተቶችን ሊያስከትሉ ይችላሉ.ባጠቃላይ አነጋገር፣ ኪት መመሪያው የ PCR ምላሽ መጠኖችን መጠቀምን ይመክራል።ብልህ አይሁኑ እና ወጪዎችን ለመቆጠብ ትናንሽ መጠኖችን ይጠቀሙ።ዓላማው ።በነጋዴዎቹ የተጠቆመው መጠን በትክክል ተፈትኗል, እና በትንሽ ጥራዞች ምክንያት የሚከሰቱትን ስህተቶች ችግር መፍታት አይችሉም.
2. የቧንቧ ጠፍጣፋው አምራች እና አንቀፅ ቁጥር
ሁሉም ሰው የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR መርህን ያውቃል።የፍሎረሰንት መሰብሰብ በዋናነት በ PCR ቱቦ ባርኔጣዎች በኩል ይካሄዳል.የ PCR ፍጆታዎችን በሚመርጡበት ጊዜ ለሁለት ነጥቦች ትኩረት ይስጡ ጥሩ የብርሃን ማስተላለፊያ እና ለመሳሪያው ተስማሚ ነው.በአጠቃላይ የዋና ምርቶች ቦርዶች እና ቱቦዎች ጥሩ ናቸው, ነገር ግን በማመቻቸት ረገድ በጥንቃቄ መምረጥ አለብዎት, አለበለዚያ መሳሪያውን መጠቀም አይችሉም.
4. ከፍተኛ ደረጃ እውቀት
MIQE (8)-qPCR ማረጋገጫ
ይህ የqPCR ቅድሚያ የሚሰጠው ጉዳይ ነው!ብዙ ጀግኖች እዚህ አሸዋ ውስጥ ወድቀዋል።እርግጥ ነው፣ እድለኞችም ሊሆኑ ይችላሉ እና ያጠኑዋቸው ጂኖች ቀላል ስለሆኑ በነፋስ በኩል በበረዶ ዋሻ ውስጥ ተንሳፈፉ።የqPCR የማረጋገጫ መረጃ የመረጃውን አስተማማኝነት ለመፈተሽ የታሰበ ነው።አስፈላጊውን የማረጋገጫ መረጃ እንደሚከተለው እንዘረዝራለን-
1.Specificity ፈተና
የዒላማ ጂን ማጉላት ልዩነት የሚፈተነው የኤሌክትሮፊዮሬሲስ ምስል ነጠላ ባንድ መሆኑን በማጣራት ነው።ቅደም ተከተል ማረጋገጥ;የከፍተኛው ካርታ ነጠላ መሆኑን ለማየት ማቅለጥ;የኢንዛይም መፍጨት ማረጋገጫ እና ሌሎች ዘዴዎች.
እዚህ, በ t ላይ እናተኩራለንእሱ የማቅለጥ ዘዴን በመጠቀም የተለየ ያልሆነ ማጉላት ትንተና.በአጠቃላይ አነጋገር ፕሪመርሮችን በምንሠራበት ጊዜ የምርት ቁርጥራጭ መጠን ከ80-200ቢፒቢ ክልል ውስጥ መሆን አለበት ይህም የ PCR ምርትን የማቅለጥ ሙቀት ከ80-85 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ክልል ያደርገዋል።ስለዚህ, የተለያዩ ጫፎች ካሉ, ሌሎች ልዩ ያልሆኑ የማጉላት ምርቶች መኖር አለባቸው;ቁንጮው ከ 80 ዲግሪ ሴንቲግሬድ በታች ከታየ በአጠቃላይ እንደ ፕሪመር ዲመር ይቆጠራል;ቁንጮው ከ 85 ዲግሪ ሴንቲግሬድ በላይ ከሆነ ፣ በአጠቃላይ የዲኤንኤ መበከል ወይም የበለጠ ልዩ ያልሆኑ ትላልቅ ቁርጥራጮችን ማጉላት ተደርጎ ይቆጠራል።
ማሳሰቢያ: አንዳንድ ጊዜ በ 80 ° ሴ ላይ አንድ ጫፍ ብቻ አለ.በዚህ ጊዜ, ይህ ጽንሰ-ሐሳብ መከበር አለበት.የማጉላት ውጤቶቹ ሁሉም የፕሪመር ዲመርሮች ሊሆኑ ይችላሉ.
መደበኛ መቅለጥ ከርቭ (ያለ ልዩ ማጉላት ያለው ነጠላ ጫፍ)
ችግር ያለበት የመቅለጥ ጥምዝ (ልዩ ያልሆነ የአስቸጋሪ ጫፎች ማጉላት)
【የጉዳይ ትንተና】
ዋናው ጫፍ አለ, ነገር ግን የፕሪመር ዲመር ከባድ ነው
ከታች ባለው ስእል ላይ ያለው ነጠላ ጫፍ የማቅለጥ ኩርባ ፍጹም ሙከራ እንደሆነ በማሰብ ዓይኖችዎን በቀላሉ ሊያታልል ይችላል, ነገር ግን ውጤቱ ሙሉ በሙሉ የተሳሳተ ነው.በዚህ ጊዜ, የሟሟ ሙቀትን መመልከት አለብን.ከፍተኛው የሙቀት መጠን ከ 80 ° ሴ በታች ነው, ይህም ሙሉ በሙሉ ፕሪመር-ዲመር ነው.
ምንም ዒላማ ቁርጥራጭ የለም፣ ሁሉም የፕሪመር ዲመሮች
እዚህ ወንድሜ ማቆም አልቻለም.ከታች የምትመለከቱት ፎቶ በሞባይል የተላከልኝ ተንቀሳቃሽ ስልክ ጋር የተነሳው ፎቶ ነው።የተጠቀመባቸው ሬጀንቶች ሁሉም በኢንዱስትሪው ውስጥ በብዛት ጥቅም ላይ የዋሉ ብራንዶች ናቸው።ከአንድ የቲ-ቅድመ-ቅጥያ ብራንድ ወደ ሌላ T-prefix ብራንድ ተለወጠ።አስቀድመው የገመቱት ይመስለኛል።አጭበርባሪው እንዲህ አለቀሰኝ:- “በመጀመሪያው ምስል ላይ ጥቅም ላይ የዋለው ሬጀንት በጣም ጥሩ ነው፣ እና ከፍተኛው ነጠላ ነው።በኋላ፣ እርስዎ የተመከሩትን ሬጀንት ከተጠቀሙ በኋላ፣ እንደ ሁለተኛው ምስል፣ የተደባለቁ ጫፎች ይሆናል።አሳዝነኸኛል.”
ሁለቱን ግራፎች ይለያዩ.በአንደኛው እይታ, አንዱ አንድ ነጠላ ጫፍ አለው, ሌላኛው ደግሞ ሁለት እጥፍ ነው.እርባና ቢስ፣ አንድ ነጠላ ጫፍ በእርግጥ ጥሩ ነው።እውነት ነው?
ከዱ ኢ የከፋ፣ ሁለቱን ሥዕሎች ከታች በሥዕሉ ላይ ካስቀመጥኳቸው ወዲያውኑ ትረዱታላችሁ።እንደ እውነቱ ከሆነ በዚህ ዓይነቱ ሥዕል በቀላሉ ሽባ ነን።በጥንቃቄ ከተመረመረ በኋላ, እኛ አገኘነው-የመጀመሪያው አሃዝ ጫፍ በ 75 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ነው, እሱም ሙሉ በሙሉ ፕሪመር ዲመር;የሁለተኛው አሃዝ ጫፍ በ 75 ° ሴ እና 82 ° ሴ ይታያል, ቢያንስ ምርቱ ይታያል.
የተማሪ ግብረመልስ ሥዕሎች
ስለዚህ ዋናው ችግር የሪኤጀንቶች ችግር አይደለም, ነገር ግን የፕሪመር ዲዛይን ችግር ነው.በተመሳሳይ ጊዜ፣ አንዳንድ ትልልቅ ብራንዶች የብረት ጥራት እንዳልነበራቸው ያረጋግጣል፣ እና ወንድሜ ከዚህ ቀደም የተናገረውን ያረጋግጣል፡ ጽሁፍህን የሚደግፈው የሬጀንት ብራንድ አይደለም።የሪጀንቶችን ስም ያደገው የእርስዎ ጽሑፍ ነው።እስቲ አስቡት፣ ቆሻሻው ሬጀንቶችን ካልቀየረ፣ የተሳሳተ መረጃ ወደ ጆርናል ይላካል፣ እና ምን ሊፈጠር እንደሚችል አሳዛኝ ይሆናል።
2. ባዶ መቆጣጠሪያ የሲቲ እሴት
አታብራሩ፣ ባዶ መቆጣጠሪያው የሲቲ እሴት ካለው፣ ብክለት አይደለምን?ሆኖም፣ የትኛው ባዶ ቁጥጥር የሲቲ እሴት እንዳለው አሁንም መረዳት ያስፈልግዎታል።ኤንቲሲ ከሆነ፣ እንደ ሪጀንት መበከል ያለ የውጭ ዲ ኤን ኤ አለ ማለት ነው።NRT ከሆነ፣ የወጣው አር ኤን ኤ የዲኤንኤ ብክለት አለው ማለት ነው።
3. መደበኛ ኩርባ
ተዳፋት እና ስሌት ቀመር ጨምሮ, PCR ውጤታማነት በቀመር በኩል ሊሰላ ይችላል.ፍጹም ሙከራ የመደበኛውን ጥምዝ ቁልቁለት ወደ 3.32፣ እና R² ወደ 0.9999 ለመቅረብ ይፈልጋል።
4. መስመራዊ ተለዋዋጭ ክልል
የምላሹ ተለዋዋጭ ክልል መስመራዊ ነው።መደበኛውን ኩርባ ለማመንጨት ጥቅም ላይ በሚውለው አብነት መሰረት፣ ተለዋዋጭ ክልሉ ቢያንስ 5 የማጎሪያ ድግግሞሾችን ማካተት አለበት፣ እና የሲቲ እሴቶችን በከፍተኛ የማጎሪያ ድግግሞሾች እና ዝቅተኛ የማጎሪያ ድግግሞሾች ላይ ያለውን ለውጥ ትኩረት ይስጡ።
5. የማወቅ ትክክለኛነት
በqPCR ውጤቶች ላይ ያሉ ለውጦች፣ ማለትም፣ ደካማ ተደጋጋሚነት፣ ማለትም፣ ደካማ ትክክለኛነት፣ የሚከሰቱት በብዙ ምክንያቶች ነው፣ ይህም የሙቀት መጠን፣ ትኩረት እና አሰራርን ጨምሮ።የቅጂ ቁጥር ሲቀንስ የqPCR ትክክለኛነት በአጠቃላይ ያነሰ ቁጥጥር ይሆናል።በሐሳብ ደረጃ በሙከራ ውስጥ ልዩነት፣ ይህ ቴክኒካል ልዩነት ከባዮሎጂካል ልዩነት የተለየ መሆን አለበት፣ እና ባዮሎጂያዊ ቅጂዎች በቡድኖች ወይም በሕክምና መካከል ያለውን የqPCR ውጤቶች ስታቲስቲካዊ ልዩነቶች በቀጥታ ሊፈቱ ይችላሉ።በተለይም ለምርመራ ምርመራዎች፣ በጣቢያዎች እና ኦፕሬተሮች ውስጥ በጣም ጥሩው የኢንተር-አሳይ ትክክለኛነት (ተደጋጋሚነት) ሪፖርት መደረግ አለበት።
6. የማወቂያ ቅልጥፍና እና LOD (በ multiplex qPCR)
ሎድ ከተገኙት አዎንታዊ ናሙናዎች 95% ዝቅተኛው ትኩረት ነው።በሌላ አነጋገር፣ በታለመው የጂን ግልባጭ ስብስብ ውስጥ ያለው የLOD ክምችት ያልተሳኩ ምላሾች ከ5% መብለጥ የለበትም።multiplex qPCR ትንታኔን በሚያደርጉበት ጊዜ በተለይም የነጥብ ሚውቴሽን ወይም ፖሊሞፈርፊዝምን በአንድ ጊዜ ለመለየት, multiplex qPCR በአንድ ቱቦ ውስጥ የበርካታ ዒላማ ቁርጥራጮች ትክክለኛነት እንዳልተጣሰ የሚያሳይ ማስረጃ ማቅረብ ያስፈልገዋል, ብዙ ማወቂያ እና ነጠላ ቱቦ ማወቂያ ውጤታማነት እና LOD ተመሳሳይ መሆን አለበት.በተለይም ከፍተኛ ትኩረትን የሚስቡ ጂኖች እና ዝቅተኛ ትኩረት ያላቸው ጂኖች በአንድ ጊዜ ሲጨመሩ ይህ ችግር ትኩረት ሊሰጠው ይገባል.
ችግሮች እና መፍትሄዎችበአጠቃላይ በqPCR ማረሚያ ላይ የሚያጋጥሟቸው ችግሮች በሚከተሉት ገጽታዎች ላይ ያተኩራሉ፡
· ልዩ ያልሆነ ማጉላት
· የፕሪመር ትኩረትን መምረጥ አስቸጋሪ እና በፕሪመር-ዲመሮች ላይ ችግር
· የማስወገጃው ሙቀት ትክክል አይደለም።
· የሁለተኛ ደረጃ መዋቅር የማጉላት ቅልጥፍናን ይነካል
ልዩ ያልሆነ ማጉላት
ልዩ ያልሆነ ማጉላትይከሰታል , በአጠቃላይ የፕሪመር ዲዛይኑ ተስማሚ እንዳልሆነ ይቆጠራል, ነገር ግን ፕሪምሮችን ለመለወጥ ካልቸኮሉ, በመጀመሪያ የሚከተሉትን ዘዴዎች መሞከር ይችላሉ (መርሁም ተያይዟል):
· የመረበሽ ሙቀትን ይጨምሩ - ደካማ የሃይድሮጂን ቁርኝቶችን ማቆየት የማይችሉትን ለማድረግ ይሞክሩ;
· የማቅለሽለሽ እና የማራዘም ጊዜን ማሳጠር - ደካማ የሃይድሮጂን ትስስር እድልን ይቀንሳል;
· የፕሪመር ትኩረትን ይቀንሱ - ተደጋጋሚ ፕሪመርሮች እና ዒላማ ያልሆኑ ክልሎችን የማሰር እድልን ይቀንሱ;
ዝቅተኛ የማጉላት ውጤታማነት
ልዩ ካልሆነ ማጉላት ተቃራኒው ሁኔታ - ዝቅተኛ የማጉላት ቅልጥፍና እና ዝቅተኛ የማጉላት ውጤታማነትን ለመቋቋም የሚወሰዱ እርምጃዎች ተቃራኒዎች ናቸው።
· የማራዘሚያ እና የማራዘም ጊዜን ያራዝሙ;
· ወደ ሶስት-ደረጃ PCR መቀየር እና የመረበሽ ሙቀትን ይቀንሱ;
· የፕሪመር ትኩረትን ይጨምሩ;
Psበ 90 ዎቹ ውስጥ የተወለዱ ብዙ የድህረ ምረቃ ተማሪዎች ሙከራዎችን እንዴት ማረም እንደሚችሉ ለማጥናት ፈቃደኞች አይደሉም ፣ እና ኪቱ ችግሩን ሙሉ በሙሉ ሊፈታ ይችላል ብለው ተስፋ ያደርጋሉ (ከተመረቁ በኋላ ወደ ሪኤጀንት ኩባንያ መሄድ ከፈለጉ) ምርምር እና ልማት ለማድረግ ፣ በእውነቱ ፣ የ reagent አምራቾች እንዲሁ እንደዚህ ያስባሉ ፣ እኔ ሞኝ ነው ብዬ ተስፋ አደርጋለሁ ፣ ሲያገኙ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል ፣ ስለሆነም የአምራቾችን እጥረት ለመፍታት ብዙ ጥረት አድርገዋል። H-bond ለመምጥ ምክንያቶች.ችግሩን በቀላሉ ለመፍታት ሞኞች አሁንም ደካማ የሃይድሮጂን ቦንዶችን የሚስብ ነገር እንዳለ ለማየት የሪጀንት ኩባንያውን መግቢያ ማንበብ አለባቸው።
የፕሪመር ትኩረትን መምረጥ አስቸጋሪ እና በፕሪመር-ዲመርስ ችግር
ዘዴ 1በአጠቃላይ አነጋገር፣ የqPCR ኪት መመሪያዎች የሚመከሩ ስርዓቶች እና የሚመከሩ የፕሪመር ውህዶች አሏቸው።
ዘዴ 2የፕሪመር ማጎሪያ ቅልመትን በማዘጋጀት ማረም።ከታች ያለው ምስል ከኩባንያው ተሰርቋል።ከታች ያለው ምስል በሶስት የፕሪመር ማጎሪያ ቅልመት (100nM፣ 250nM፣ 500nM) እና በአራት የአብነት ማጎሪያ ድግግሞሾች (0.1ng፣ 1ng፣ 10ng፣ 100ng) የተሰሩ የፍሎረሰንት መጠናዊ ውጤቶችን ያሳያል።የሙከራ ውጤቶቹ የሲቲ እሴት እንደሚከተለው ቀርቧል።
የፕሪመር ማጎሪያ ምርጫ እያንዳንዱን የፕሪመር ትኩረትን በሚከተለው መስመር ያዋህዱ።
የፕሪመር ማጎሪያ ምርጫ ግልፅ ነው ፣ የ 100nM እና 250nM የፕሪመር ማጎሪያ መስመራዊ ግንኙነት የተሻለ ነው ፣ እና የ 500nM የፕሪመር ማጎሪያ መስመራዊ ግንኙነት በአንጻራዊ ሁኔታ ደካማ ነው።በ 100nM እና 250nM የ 250nM የሲቲ እሴት በአንጻራዊ ሁኔታ ትንሽ ነው, ስለዚህ በጣም ጥሩው የፕሪመር ክምችት 250nM ነው.በአጠቃላይ ከባድ ፕሪመር-ዲመሮች በማቅለጥ ኩርባ ውስጥ ሊታዩ ይችላሉ.የተነደፉት ፕሪመር-ዲመሮችን ማስወገድ ካልቻሉስ?
ዘዴ 3: የመጀመሪያዎቹን መጠን ይቀንሱ እና የመረበሽ ሙቀትን ይጨምሩ (ማብራራት አያስፈልግም).
የአናኒንግ ሙቀት ተጨባጭ ዋጋ 60 ° ሴ ነው.እርግጠኛ ካልሆኑ ይበልጥ ተስማሚ የሆነ የአናሎግ ሙቀት እንዴት እንደሚመርጡ?መልሱ ከፕሪመር ማጎሪያ ምርጫ ጋር ተመሳሳይ ነው -ቀስ በቀስ ፈተና.ችግሩን በምሳሌ ለማስረዳት ከባዮ-ራድ ኩባንያ ፎቶ አንሳ።ለአንድ የተወሰነ የዒላማ ቁርጥራጭ ለማጉላት ስምንት የሙቀት ደረጃዎችን ያቀናብሩ ፣ እያንዳንዳቸው ሦስት ድግግሞሽ ያላቸው እና የተገኘው የማጉላት ኩርባ እንደሚከተለው ነው።
የሙቀት መጠን ምርጫ;
· 70 ° ሴ, 69 ° ሴ - በመሠረቱ, ፕሪሚሶች ሊጣመሩ አይችሉም, ስለዚህ ምንም ማጉላት የለም.
· 67.3 ° ሴ - መጀመሪያ ላይ አነስተኛ መጠን ያለው ማጉላት አለ, እና የሲቲ እሴት በአንጻራዊነት ትልቅ ነው.
· 64.5 ° ሴ - - የሲቲ እሴት ይቀንሳል.
· በ60.7°C፣ 58.0°C፣ 56.2°C እና 55.0°C፣ የሲቲ እሴቶች በመሠረቱ የተረጋጋ የመሆን አዝማሚያ ይታይባቸው ነበር፣ ነገር ግን የመጨረሻው የፍሎረሰንት እሴቶቹ የተለያዩ ናቸው።
እንዴት መምረጥ ይቻላል?መርህ፡ የመጀመሪያው መርህ ከፍ ያለ የሲቲ እሴት ነው።ለተመሳሳዩ የሲቲ እሴት፣ ማደብዘዝን እና ልዩ ያልሆነን ማጉላትን ለማስቀረት ከፍ ያለ የማደንዘዣ ሙቀት ይምረጡ።ምንም እንኳን በ 55 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ከፍ ያለ የፍሎረሰንት ዋጋ ቢኖረውም, በውስጡም ዲሜሮች ወይም ልዩ ያልሆኑ ማጉያዎች ሊኖሩ ይችላሉ.
ግን እንደ እርስዎ ብልህ ከሆኑ በእርግጠኝነት ያስባሉ-በአመክንዮአዊ አነጋገር ፣ የ PCR ምላሽ በጣም ልዩ ከሆነ ፣ የፕሪመር ማጎሪያው ከዝቅተኛው መስፈርት በላይ እስከሆነ ድረስ ፣ ከፍተኛ እና ዝቅተኛ ነጥቦቹ ምንም ውጤት ሊኖራቸው አይገባም ፣ ልክ እንደ ፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች እና ዲኤንቲፒዎች።በእርግጥ፣ የማደንዘዣው ሙቀት በትክክል እስከተመቻቸ ድረስ፣ የፕሪመር ማጎሪያው በሲቲ እሴት ላይ ያለው ተጽእኖ በተፈጥሮው ይቀንሳል።
የማደንዘዣው የሙቀት መጠን በትክክል ተስተካክሏል, እና የፕሪመር ማተኮር በሲቲ ላይ ያለው ተጽእኖ ይቀንሳል
የሁለተኛ ደረጃ መዋቅር የማጉላት ቅልጥፍናን ይነካል
ችግሩን በምሳሌ ለማስረዳት ምስሉን ከባዮ ራድ እናንሳ።እንዲሁም የሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ያለው ጂን ለማጉላት የሙቀት ቅልጥፍናን ይቀይሳል።
ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ይወጣል
የሙቀቱ መጠን እየቀነሰ ሲሄድ ምርቶች መታየት ሲጀምሩ እና የሲቲ እሴት ወደ ፊት እየገፋ ሲሄድ ዝቅተኛው እሴት በ 60.7 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ላይ ሲደርስ እና ከዚያም የሙቀት መጠኑ እየቀነሰ ሲሄድ የሲቲ እሴት ትልቅ ይሆናል.በተቃራኒው, የሙቀት መጠኑ እየጨመረ ሲሄድ, ሁለተኛው መዋቅር ይከፈታል እና የማጉላት ውጤታማነት ይጨምራል.የተወሰነ የሙቀት መጠን ከደረሰ በኋላ, የሙቀት መጠኑን መጨመር የማጉላትን ውጤታማነት ማሻሻል አይችልም.ምክንያቱም በዚህ ጊዜ ፕሪመርስ በተረጋጋ ሁኔታ ሊጣመሩ አይችሉም.ስለዚህምየሙቀት መጠኑን ከዝቅተኛው የሲቲ እሴት ይፈልጉ, የሁለተኛውን መዋቅር አብነት ለማጉላት በጣም ጥሩው የሙቀት መጠን ነው!እርግጥ ነው, ብልህ ሞኞች አስፈላጊ ካልሆነ ፕሪሚኖችን መለወጥ እና የሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ክልልን ማስወገድ የተሻለ እንደሆነ ማወቅ አለባቸው.
5. የመተግበሪያ ደረጃ
MIQE-የመረጃ ትንተና
የመረጃ ትንተናው በዋናነት የሚሰጠው በፍሎረሰንት መጠናዊ PCR መሳሪያ ነው።በቀደመው ጽሁፍ ውስጥ ብዙ የመረጃ ትንተና ስራዎች ተሰርተዋል, ለምሳሌ ባዶ መቆጣጠሪያ, በሙከራው ንድፍ ውስጥ ተብራርቷል.የውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂኖች, ተደጋጋሚ ቁጥሮች, ወዘተ ተብራርተዋል.እዚህ በዋናነት የqPCR አተገባበርን እናብራራለን።
qPCR በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላል፣ እና የሙከራ ማረጋገጫ እና የኑክሊክ አሲድ ምርመራ በብዛት ጥቅም ላይ የዋሉ ሁኔታዎች ናቸው።
ፍጹም መጠን
ሎግ (የመጀመሪያ ትኩረት) ከዑደቶች ብዛት ጋር ቀጥተኛ ግንኙነት አለው።አንድ መደበኛ ኩርባ ከሚታወቅ የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር ጋር ካለው መደበኛ መሳል ይቻላል ፣ ማለትም ፣ የማጉላት ምላሽ መስመራዊ ግንኙነት ሊገኝ ይችላል።እንደ ናሙናው የሲቲ እሴት መሰረት, በናሙናው ውስጥ ያለው ትኩረት ሊሰላ ይችላል.የሚካተቱት የአብነት ብዛት።
ፍፁም የቁጥር ስሌት ዘዴ
ፍፁም መመዘኛ በመደበኛ ኩርባ ላይ የተመሰረተ መሆን አለበት.መደበኛ ኩርባ ለመሥራት አንድ ደረጃ ያስፈልጋል.ብዙውን ጊዜ, ደረጃው የታለመውን ጂን በመዝጋት የተገኘ ፕላዝሚድ ነው.ለምንድን ነው ፕላዝማድ የሆነው?ምክንያቱም ክብ ቅርጽ ያለው የፕላዝማ ዲ ኤን ኤ በጣም የተረጋጋ ነው.ደረጃውን የጠበቀ ምርትን ከ 5 እስከ 6 ግራድ ውስጥ በድርብ ጥምርታ (10-fold dilution) መሰረት ያርቁ, እና በሚቀዘቅዙበት ጊዜ ተመሳሳይነት ላይ ትኩረት ይስጡ.የሲቲ እሴት በ15-30 መካከል ይውረድ።
መደበኛ ዝግጅት
በተመሳሳይ ጊዜ, የሚሞከረው ናሙና እንዲሁ መሟሟት አለበት (የሟሟ ሁኔታን ያስታውሱ) እና የሲቲ እሴቱ በ15-30 መካከል መውረድ አለበት።መደበኛው ምርት + የሚሞከረው ናሙና በማሽኑ ላይ አንድ ላይ ተቀምጧል.ከሩጫው በኋላ አንድ መደበኛ ኩርባ ከመደበኛው ንጥረ ነገር ጋር ተሠርቷል, እና የሚሞከሩት ናሙናዎች ትኩረቱን ለማስላት ወደ መደበኛው ኩርባ መጡ.
የሄፐታይተስ ቢ ቫይረስ HBV መጠን በ 1 ሚሊር ደም ውስጥ ያለውን የቫይረስ ቅጂ ቁጥር ለማስላት የሚያስችል የተለመደ ፍፁም መለኪያ ነው።
የቅጂ ቁጥር ስሌት
የሚሞከር የናሙና ትኩረት (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
ናሙና ሞለኪውላዊ ክብደት = የመሠረት ብዛት × 324
የሚሞከረው ናሙና ቅጂ ቁጥር (ኮፒ/ul) = የሚመረመረው ናሙና ትኩረት / የናሙና ሞለኪውላዊ ክብደት × 6 × 1014
የቅጂ ቁጥር ስሌት ዘዴ
ከላይ ያለው ብዛቱን ለመወሰን ስሌት ዘዴ ነው.ይህ ከመለስተኛ ሁለተኛ ደረጃ ትምህርት ቤት ከተመረቀ በኋላ ሊፈታ የሚችል የሂሳብ ችግር ነው, እና የሂሳብ ችግሮች በአጠቃላይ በኮምፒዩተር ይቀረፋሉ.ካልገባህ ለመግባባት መምጣት ትችላለህ።
አንጻራዊ መጠን
አንጻራዊ መጠን በዋነኛነት በሳይንሳዊ ምርምር ውስጥ ጥቅም ላይ ይውላል።በ 1 ሚሊር ደም ውስጥ ስንት ቫይረሶች አሉ, እና እሱ የዲ ኤን ኤ ቫይረስ ነው, ይህ በአንጻራዊ ሁኔታ የሚወሰን ክስተት ነው: የደም መጠን ሊታወቅ ይችላል, እና የዲ ኤን ኤ ቫይረስ በአንጻራዊነት የተረጋጋ ነው.ነገር ግን፣ በቅጠሉ ውስጥ ያለውን የአንድ የተወሰነ ዘረ-መል (ጅን) ግልባጭ ብዛት ማነጻጸር ለእኛ ከባድ ነው፣ ምክንያቱም የቅጠሉን መጠን፣ ክብደት እና ርህራሄ ለማወቅ አስቸጋሪ ስለሆነ፣ የተወሰደው አር ኤን ኤ ምን ያህል እንደሆነ ለማወቅ አስቸጋሪ ነው፣ እና የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍናም ለማወቅ አስቸጋሪ ነው፣ ያም ማለት ማንኛውም እርምጃ የሙከራ ውሂቡ ስህተቶች እንዲኖሩት ሊያደርግ ይችላል እና ጥቅም ላይ ሊውል አይችልም።
ስለዚህ፣ አንጻራዊ መጠን አንድን አካል ማስተዋወቅ አለበት፡-የውስጣዊው የማጣቀሻ ጂን .
በሌላ አገላለጽ አንጻራዊ መጠን በትክክል በዒላማው ጂን እና በውስጣዊው የማጣቀሻ ጂን መካከል ያለው ንጽጽር ነው።ከተመሳሳዩ ቲሹ እና ተመሳሳይ ሕዋስ ጋር ሲነፃፀር የናሙና መጠን ፣ የአር ኤን ኤ ማውጣት መጠን ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ እና የ PCR ውጤታማነት ተጽዕኖ በአንጻራዊ ሁኔታ ትንሽ ነው።በትንሽ የናሙና መጠን ምክንያት ሁለቱም የውስጥ ማጣቀሻ ጂኖች እና የታለመ ጂኖች በአንጻራዊ ሁኔታ ተቀንሰዋል።ከዚህ በፊት ተመሳሳይነት እና መረጋጋት ላይ አፅንዖት የሰጠነው ለዚህ ነው።
የውስጥ ማጣቀሻ ጂኖች በአጠቃላይ ናቸውየቤት አያያዝ ጂኖች(ቤትን የሚጠብቁ ጂኖች), በሁሉም ሴሎች ውስጥ በተረጋጋ ሁኔታ የሚገለጹትን የጂኖች ክፍል የሚያመለክቱ እና ምርቶቻቸው የሴሎች መሰረታዊ የህይወት እንቅስቃሴዎችን ለመጠበቅ አስፈላጊ ናቸው.
ይህንን ፅንሰ-ሀሳብ አታደናግር።የቤት አያያዝ ጂኖች ባዮሎጂያዊ ተግባር ቃላት ሲሆኑ የውስጥ ማጣቀሻ ጂኖች ደግሞ የሙከራ ቴክኒካዊ ቃላት ናቸው።የቤት አያያዝ ጂኖች እንደ ውስጣዊ ማጣቀሻ ጂኖች ከመመረጣቸው በፊት ማረጋገጫ ማለፍ አለባቸው።
ለምሳሌ፣ በተለያዩ የቲሹ ሕዋሶች ውስጥ ያላቸውን የገለፃ ደረጃ ለመፈተሽ ከዚህ በታች ባለው ምስል ላይ በርካታ የቤት አያያዝ ጂኖችን መርጠናል፣ እና የ β-2-microglobulin አገላለጽ ደረጃ ከሌሎቹ ሶስት ጂኖች በጣም የተለየ ሆኖ አግኝተነዋል።
የውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂን የማረም ተግባር ከተረዳ በኋላ, ሁለት ስልተ ቀመሮች የሚመነጩት የውስጣዊው የማጣቀሻ ጂን በማስተዋወቅ ምክንያት ነው.
· ድርብ መደበኛ ከርቭ ዘዴ
· 2 - △△ ሲቲ ዘዴ (የሲቲ እሴት ማወዳደር ዘዴ)
ዝርያዎችን እና የጂን ተግባራትን ለማጥናት ፍላጎት ካሎት እባክዎን በአልጎሪዝም ላይ ያለውን ጥናት ይተዉ እና ቀመሮችን በቀጥታ ይጠቀሙ ወይም ማሽኖችን በቀጥታ ይጠቀሙ;በሂሳብ እና ምህንድስና ቀጥተኛ ሰው ከሆንክ እባክህ ነፃ ሁን።
ድርብ መደበኛ ከርቭ ዘዴ
የቁጥጥር ናሙናውን ኢላማ እና የቤት አያያዝ ዘረ-መል (ጅን) እና ናሙናውን በመደበኛው ከርቭ በኩል በመለካት እና ከዚያም በተመጣጣኝ አገላለጽ ደረጃ ባለው ስሌት ቀመር መሰረት አንጻራዊ እሴቱን ያሰሉ።
ጥቅሞች: ቀላል ትንታኔ, በአንጻራዊነት ቀላል የሙከራ ማመቻቸት
ጉዳት፡ ለእያንዳንዱ ጂን፣ እያንዳንዱ ዙር ሙከራዎች መደበኛ ኩርባ ማድረግ አለባቸው
አፕሊኬሽን፡- በጂን አገላለጽ ደንብ ጥናት ውስጥ ከሁለቱ በብዛት ጥቅም ላይ ከሚውሉት እና ከሚታወቁት አንጻራዊ የመጠን ዘዴዎች አንዱ
ቀመሩ እንደሚከተለው ነው።
ምሳሌዎች የሚከተሉት ናቸው።
በቁጥር ውጤቱ ላይ በመመስረት አንጻራዊውን መጠን አስሉ
2 - △△ ሲቲ ዘዴ (የሲቲ እሴት ማወዳደር ዘዴ)
ጥቅማ ጥቅሞች: መደበኛ ኩርባ ማድረግ አያስፈልግም
ጉዳቶች: የማጉላት ብቃቱ ወደ 100% እንደሚጠጋ ይገመታል;የመደበኛ ልዩነት <5% ነው, እና መደበኛ ኩርባ እና በእያንዳንዱ ማጉያ መካከል ያለው ቅልጥፍና ወጥነት ያለው ነው ተብሎ ይታሰባል;የሙከራ ሁኔታዎችን ማመቻቸት የበለጠ የተወሳሰበ ነው.
አፕሊኬሽን፡- በጂን አገላለጽ ደንብ ጥናት ውስጥ ከሁለቱ በብዛት ጥቅም ላይ ከሚውሉት እና ከሚታወቁት አንጻራዊ የመጠን ዘዴዎች አንዱ
እርግጥ ነው, የአቦምፒውት ውጤታማነት ፍጹም ነው. የ target ላማው ኤንጂናል 0.95 ከሆነ, የ AMPLENGENGENGENTENTENT ግን ከ 1-5-5. t
እስካሁን ድረስ፣ ስለ ፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ያለው ይዘት ወደ ማብቂያው ደርሷል።
የልጥፍ ሰዓት፡ ኤፕሪል 06-2023
