በማዕከላዊ ዶግማ ውስጥ አር ኤን ኤ በዲ ኤን ኤ እና በፕሮቲን አገላለጽ መካከል ያለው ግልባጭ አስታራቂ እንደሆነ ይታወቃል።ዲ ኤን ኤን ከማግኘቱ ጋር ሲነጻጸር, አር ኤን ኤ መገኘቱ በኦርጋኒክ ውስጥ ያለውን የጂን አገላለጽ በተጨባጭ ሊያንፀባርቅ ይችላል.አር ኤን ኤን የሚያካትቱ ሙከራዎች፡- qRT-PCR፣ RNA-Seq እና ፊውዥን ጂን ማወቂያ ወዘተ.በራሱ አር ኤን ኤ ባህሪያት ላይ በመመስረት (የአር ኤን ኤው የስኳር ቀለበት ከዲኤንኤው የስኳር ቀለበት አንድ ተጨማሪ ነፃ የሃይድሮክሳይል ቡድን አለው)፣ በአካባቢው ካሉ በርካታ RNases ጋር ተዳምሮ፣ አር ኤን ኤ የበለጠ ያልተረጋጋ እና ከዲኤንኤ ለመዋረድ ቀላል ነው።ቆሻሻ መጣያ፣ የቆሻሻ መጣያ፣ የአር ኤን ኤ ጥራት ጥሩ ካልሆነ፣ የሙከራ ውጤቶቹ አጥጋቢ ያልሆኑ፣ በተለይም እንደ ትክክለኛ ያልሆነ መረጃ ወይም ደካማ ተደጋጋሚነት መገለጥ አለባቸው።ስለዚህ, ለአር ኤን ኤ ማቀነባበር የበለጠ ትኩረት ሊሰጠው ይገባል, እና የጥራት ቁጥጥር ማገናኛ ደግሞ ተከታታይ የሙከራ መረጃዎችን ትክክለኛነት እና ትክክለኛነት ለማረጋገጥ የበለጠ አስፈላጊ ነው.

ለአር ኤን ኤ የጥራት ቁጥጥር በአጠቃላይ የሚከተሉት የተለመዱ ዘዴዎች አሉ።

• Spectrophotometry
• agarose gel electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR
• Qubit fluorescent ማቅለሚያ ዘዴ

01 Spectrophotometry

አር ኤን ኤ የተጣመረ ድርብ ቦንድ አለው እና በ260nm የሞገድ ርዝመት ላይ የመምጠጥ ጫፍ አለው።እንደ ላምበርት-ቢር ህግ፣ የአር ኤን ኤውን ትኩረት ከምስጡ ጫፍ በ260nm ማስላት እንችላለን።በተጨማሪም፣ በ260nm፣ 280nm እና 230nm የመምጠጥ ጫፎች ጥምርታ መሰረት የአር ኤን ኤ ንፅህናን ማስላት እንችላለን።280nm እና 230nm በቅደም ተከተል የፕሮቲኖች እና የትናንሽ ሞለኪውሎች የመጠጫ ጫፎች ናቸው።የA260/A280 እና A260/A230 ብቃት ያለው አር ኤን ኤ ንፅህና ከ 2 በላይ መሆን አለበት።ከ2 በታች ከሆነ ይህ ማለት በአር ኤን ኤ ናሙና ውስጥ የፕሮቲን ወይም የትንሽ ሞለኪውል ብክለት አለ እና እንደገና መንጻት ያስፈልገዋል ማለት ነው።የብክለት ምንጮች የታችኛው ተፋሰስ ሙከራዎች ላይ ተጽእኖ ይኖራቸዋል፣ ለምሳሌ የ PCR ምላሽን የማጉላት ብቃትን መከልከል፣ ይህም ትክክለኛ ያልሆነ የቁጥር ውጤቶች ያስከትላል።የአር ኤን ኤ ንፅህና በቀጣዮቹ ውጤቶች ላይ ትልቅ ተጽእኖ አለው፣ ስለዚህ ስፔክትሮፎቶሜትሪ በአጠቃላይ በኒውክሊክ አሲድ ሙከራዎች የመጀመሪያ ደረጃ ላይ አስፈላጊ የጥራት ቁጥጥር አገናኝ ነው።

ምስል 1. የተለመደው አር ኤን ኤ / ዲ ኤን ኤ የመምጠጥ ስፔክትረም

02 Agarose gel electrophoresis

ከንጽህና በተጨማሪ የአር ኤን ኤ ጥራትን ለመገምገም አስፈላጊ ከሆኑት አመልካቾች ውስጥ አንዱ የ RNA ትክክለኛነት ነው.የአር ኤን ኤ ማሽቆልቆል በናሙናው ውስጥ ብዙ ቁጥር ያላቸውን አጫጭር ቁርጥራጮችን ያመጣል, ስለዚህ በማጣቀሻው ቅደም ተከተል በተሳካ ሁኔታ ሊገኙ የሚችሉ እና የተሸፈኑ የ RNA ቁርጥራጮች ቁጥር ይቀንሳል.የአር ኤን ኤ ትክክለኛነት በ 1% አጋሮዝ ጄል በጠቅላላው አር ኤን ኤ በኤሌክትሮፊዮራይዝስ ሊረጋገጥ ይችላል።ይህ ዘዴ ጄል እራስዎ ማዋቀር ወይም አስቀድሞ የተዘጋጀውን ኢ-ጄል ™ ሲስተም ለትክህትነት መፈተሻ መጠቀም ይችላል።ከጠቅላላው አር ኤን ኤ ከ 80% በላይ የሆነው ራይቦሶማል አር ኤን ኤ ነው ፣ አብዛኛዎቹ 28S እና 18S አር ኤን ኤ (በአጥቢ አጥቢ እንስሳት ስርዓት) ያቀፈ ነው።ጥሩ ጥራት ያለው አር ኤን ኤ 28S እና 18S ብሩህ አሞሌዎችን በቅደም ተከተል በ5 Kb እና 2 Kb ሁለት ግልጽ የሆኑ ብሩህ አሞሌዎችን ያሳያል እና ሬሾው ወደ 2፡1 ይጠጋል።በተበታተነ ሁኔታ ውስጥ ከሆነ, የአር ኤን ኤ ናሙና ተበላሽቶ ሊሆን ይችላል ማለት ነው, እና የአር ኤን ኤ ጥራትን የበለጠ ለመፈተሽ በኋላ ላይ የተገለጸውን ዘዴ ለመጠቀም ይመከራል.

ምስል 2. የተበላሸ (ሌይን 2) እና ያልተነካ አር ኤን ኤ (ሌይን 3) በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮርስስ ላይ ማወዳደር

03 Agilent Bioanalyzer

የአር ኤን ኤውን ታማኝነት በቀላሉ እና በፍጥነት ለመለየት ከሚረዳው የአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮሬሲስ ዘዴ በተጨማሪ የአር ኤን ኤውን ትክክለኛነት ለማወቅ Agilent bioanalyzer ልንጠቀም እንችላለን።የአር ኤን ኤ ትኩረትን እና ታማኝነትን ለመገምገም የማይክሮ ፍሎይዲክስ፣ ካፊላሪ ኤሌክትሮፊዮሬሲስ እና ፍሎረሰንስ ጥምረት ይጠቀማል።አብሮ የተሰራውን አልጎሪዝም በመጠቀም የአር ኤን ኤ ናሙናን መገለጫ ለመተንተን፣ Agilent bioanalyzer የማጣቀሻ አር ኤን ኤ ኢንተግሪቲ እሴት፣ አር ኤን ኤ ኢንተግሪቲ ቁጥር (ከዚህ በኋላ RIN ይባላል) [1] ማስላት ይችላል።የ RIN ትልቅ ዋጋ, የ RNA ትክክለኛነት ከፍ ያለ ነው (1 እጅግ በጣም የተበላሸ ነው, 10 በጣም የተሟላ ነው).አር ኤን ኤን የሚያካትቱ አንዳንድ ሙከራዎች RINን ለጥራት ግምገማ እንደ መለኪያ መጠቀምን ይጠቁማሉ።በቴርሞ ፊሸር ኦንኮሚን ፓነል ተከታታይ ውስጥ የቢ ሴል እና ቲ ሴል አንቲጂን ተቀባይዎችን ለመለየት የሚያገለግለው የ Oncomine™ Human Immune Repertoire መመሪያዎች (ከዚህ በኋላ NGS እየተባለ የሚጠራ) ሙከራዎችን እንደ ምሳሌ በመውሰድ የ RIN እሴቶችን ከ 4 በላይ የሆኑ ናሙናዎች ይጠቁማሉ (ምስል 3)።ለተለያዩ ፓነሎች የተለያዩ የሚመከሩ ክልሎች አሉ፣ እና ብዙ ጊዜ ከፍ ያለ RIN የበለጠ ውጤታማ ውሂብ ሊያመጣ ይችላል።

ምስል 3፣ በ Oncomine™ Human Immune Repertoire ሙከራዎች፣ ከ 4 በላይ RIN ያላቸው ናሙናዎች የበለጠ ውጤታማ ንባቦችን እና የቲ ሴል ክሎኖችን መለየት ይችላሉ።【2】

ሆኖም፣ የ RIN እሴትም አንዳንድ ገደቦች አሉት።ምንም እንኳን RIN ከኤንጂኤስ የሙከራ ውሂብ ጥራት ጋር ከፍተኛ ግንኙነት ቢኖረውም ለ FFPE ናሙናዎች ተስማሚ አይደለም.የ FFPE ናሙናዎች ለረጅም ጊዜ በኬሚካል ታክመዋል፣ እና የተገኘው አር ኤን ኤ በአጠቃላይ በአንጻራዊ ሁኔታ ዝቅተኛ የ RIN እሴት አለው።ይሁን እንጂ ይህ ማለት የሙከራው ውጤታማ መረጃ አጥጋቢ መሆን አለበት ማለት አይደለም.የ FFPE ናሙናዎችን ጥራት በትክክል ለመገምገም ከ RIN ሌላ መለኪያዎችን መጠቀም አለብን።ከ RIN በተጨማሪ Agilent bioanalyzer የDV200 ዋጋን እንደ አር ኤን ኤ ጥራት መገምገሚያ መለኪያ አድርጎ ማስላት ይችላል።DV200 በአር ኤን ኤ ናሙና ውስጥ ከ200 ቢፒ በላይ የሆኑትን ቁርጥራጮች መጠን የሚያሰላ መለኪያ ነው።DV200 ከ RIN የተሻለ የ FFPE ናሙና ጥራት አመልካች ነው።በ FFPE ለተመረተው አር ኤን ኤ በጥራት ሊገኙ ከሚችሉ ጂኖች ብዛት እና ከጂኖች ልዩነት ጋር በጣም ከፍተኛ ትስስር አለው።ምንም እንኳን DV200 በ FFPE የጥራት ማወቂያ ላይ ያሉ ጉድለቶችን የሚሸፍን ቢሆንም፣ Agilent bioanalyzer አሁንም በአር ኤን ኤ ናሙናዎች ውስጥ ያሉትን የጥራት ችግሮች፣ በናሙናዎቹ ውስጥ አጋቾች መኖራቸውን ጨምሮ መተንተን አይችልም።ማገጃዎች እራሳቸው የታችኛው ተፋሰስ ሙከራዎችን የማጉላት ብቃት ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድሩ እና ጠቃሚ መረጃዎችን መጠን ይቀንሳሉ።በናሙናው ውስጥ አጋቾቹ መኖር አለመኖራቸውን ለማወቅ ቀጥሎ የተገለጸውን የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ዘዴን ልንጠቀም እንችላለን።

04 የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR

የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ዘዴ በናሙናው ውስጥ ያሉትን ማገጃዎች መለየት ብቻ ሳይሆን በ FFPE ናሙና ውስጥ ያለውን የ RNA ጥራት በትክክል ያንፀባርቃል።ከአግላይንት ባዮሎጂካል ተንታኞች ጋር ሲነፃፀር፣ የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ መሳሪያዎች በሰፊው አተገባበር ምክንያት በዋና ባዮሎጂካል ላቦራቶሪዎች ውስጥ በጣም ታዋቂ ናቸው።የአር ኤን ኤ ናሙናዎችን ጥራት ለመፈተሽ እንደ GUSB (የድመት ቁጥር Hs00939627) ላሉ የውስጥ ማጣቀሻ ጂኖች የፕሪመር መመርመሪያዎችን መግዛት ወይም ማዘጋጀት ብቻ ያስፈልገናል።ፍፁም የመጠን ሙከራዎችን ለማካሄድ ይህንን የፕሪመር፣ መመርመሪያዎች እና ደረጃዎች ስብስብ (ጠቅላላ የታወቁ ትኩረት አር ኤን ኤ) በመጠቀም ውጤታማው የአር ኤን ኤ ፍርፋሪ ትኩረት እንደ አር ኤን ኤ ጥራት ግምገማ ደረጃ (Functional RNA Quantitation (FRQ) በአጭሩ) ሊሰላ ይችላል።በኤንጂኤስ ሙከራ፣ የአር ኤን ኤ ናሙናዎች FRQ ከውጤታማው የውሂብ መጠን ጋር በጣም ከፍተኛ ትስስር እንዳለው አግኝተናል።ከ 0.2ng/uL FRQ በላይ ለሆኑ ሁሉም ናሙናዎች ቢያንስ 70% ንባቦች የማጣቀሻውን ቅደም ተከተል በትክክል ሊሸፍኑ ይችላሉ (ምስል 4)።

ምስል 4፣ በFluorescence Quantitative ዘዴ የተገኘው የ FRQ እሴት በጣም ከፍተኛ ትስስር (R2>0.9) በኤንጂኤስ ሙከራ ውስጥ ከተገኘው ውጤታማ መረጃ ጋር።ቀይ መስመር የFRQ እሴት ከ 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) ጋር እኩል ነው።【4】

ለ FFPE ናሙናዎች ተግባራዊ ከመሆኑ በተጨማሪ፣ የእውነተኛ ጊዜ መጠናዊ PCR ዘዴ በናሙናዎች ውስጥ ያሉ አጋቾችን በብቃት መከታተል ይችላል።የሚታየውን ናሙና በ Internal Positive Control (IPC) እና Assay ወደ ምላሽ ሲስተሙ እንጨምራለን እና ከዚያ የሲቲ እሴትን ለማግኘት የፍሎረሰንስ ብዛትን እንሰራለን።የሲቲ እሴቱ ከሲቲ እሴቱ በኋላ በምንም-ናሙና ምላሽ ውስጥ ከቀረ፣ ይህ አመላካች በናሙናው ውስጥ እንዳለ እና በምላሹ ውስጥ የማጉላት ብቃትን እንደሚገታ ያሳያል።

05 Qubit fluorescent ማቅለሚያ ዘዴ

Qubit Fluorometer ለኒውክሊክ አሲድ ትኩረት እና ንፅህና ለመለየት በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለው አነስተኛ መሳሪያ ነው፣ ይህም ለመስራት ቀላል እና በሁሉም ሞለኪውላር ባዮሎጂ ቤተ ሙከራ ውስጥ አለ።የኒውክሊክ አሲድ መጠንን በመለየት እና ኑክሊክ አሲድ-ማያያዣ የፍሎረሰንት ቀለም (Qubit detection reagent) በትክክል ያሰላል።ኩቢት ከፍተኛ ስሜታዊነት እና ልዩነት አለው፣ እና አር ኤን ኤ በትክክል ወደ pg/µL ትኩረት መለካት።የኒውክሊክ አሲድ ክምችትን በትክክል የመለካት ከሚታወቀው ችሎታ በተጨማሪ የቴርሞ ፊሸር የቅርብ ጊዜው አዲስ ሞዴል ኩቢት 4.0 የአር ኤን ኤውን ትክክለኛነት መለየት ይችላል።Qubit 4.0's RNA detection system (RNA IQ Assay) በአንድ ጊዜ ሁለት ልዩ የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎችን በመለየት የአር ኤን ኤውን ትክክለኛነት ያረጋግጣል።እነዚህ ሁለት የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች እንደ ቅደም ተከተላቸው ከትላልቅ ቁርጥራጮች እና ትናንሽ የአር ኤን ኤ ቁርጥራጮች ጋር ማያያዝ ይችላሉ።እነዚህ ሁለት የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች በናሙናው ውስጥ የሚገኙትን ትላልቅ የአር ኤን ኤ ስብርባሪዎች መጠን ያመለክታሉ፣ እናም ከዚህ በመነሳት የአር ኤን ኤውን ጥራት የሚወክለው የአይኪው (ኢንተግሪቲ እና ጥራት) እሴት ሊሰላ ይችላል።የIQ እሴቱ በFFPE እና FFPE ላልሆኑ ናሙናዎች ተፈጻሚ ነው፣ እና በቀጣይ ተከታታይ ጥራት ላይ ትልቅ ተጽእኖ አለው።የኤንጂኤስ ሙከራዎችን እንደ ምሳሌ በመውሰድ በIon torrent™ መድረክ ላይ በተደረጉት የ RNA-Seq የሙከራ ሙከራዎች ከ 4 በላይ የሆኑ የIQ እሴቶች ያላቸው አብዛኛዎቹ ናሙናዎች ቢያንስ 50% ውጤታማ ንባብ ነበራቸው (ምስል 5)።ከላይ ከተጠቀሱት የፍተሻ ዘዴዎች ጋር ሲነጻጸር, Qubit IQ Assay ለመስራት የበለጠ ምቹ እና ትንሽ ጊዜ የሚወስድ ብቻ ሳይሆን (በአምስት ደቂቃዎች ውስጥ) በሚለካው መለኪያ IQ እሴት እና በታችኛው ተፋሰስ ሙከራዎች የውሂብ ጥራት መካከል ትልቅ ትስስር አለው.

ምስል 5፣ በ Qubit RNA IQ እሴት እና በካርታው ላይ በተሰራው የ RNA-Seq መካከል ትልቅ ትስስር አለ።【5】

ከላይ ባለው መግቢያ፣ ሁሉም ሰው ስለ የተለያዩ አር ኤን ኤ የጥራት ቁጥጥር ዘዴዎች በቂ ግንዛቤ እንዳለው አምናለሁ።በተግባር, መምረጥ ይችላሉበናሙና ዓይነት እና በነባር መሳሪያዎች መሰረት ተጓዳኝ ዘዴ.የአር ኤን ኤ ጥራትን በሚገባ በመቆጣጠር ብቻ በቀጣይ የናሙና ጥራት ጉድለት ምክንያት የሚደረጉ ሙከራዎችን ውድቅ ማድረግ የምንችለው ውድ ጊዜን፣ ጉልበትንና ወጪን መቆጠብ እንችላለን።

የማጣቀሻ ምርቶች፡-

የእንስሳት ጠቅላላ አር ኤን ኤ ማግለል ስብስብ

የሕዋስ ጠቅላላ አር ኤን ኤ ማግለል ስብስብ

ማጣቀሻዎች

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN፡ የአር ኤን ኤ ኢንቴግሪቲ ቁጥር ለአር ኤን ኤ መለኪያዎች የንፁህነት እሴቶችን ለመመደብ።BMC ሞለኪውላር ባዮል 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire የተጠቃሚ መመሪያ (የህትመት ቁጥር. MAN0017438 Rev. C.0)።

【3】ሊያ ሲ ዌህማስ፣ ቻርለስ ኢ ዉድ፣ ብሪያን ቾርሊ፣ ካሮል ኤል ያክ፣ ጌይል ኤም ኔልሰን፣ ሱዛን ዲ ሄስተር፣ አር ኤን ኤን ለመገምገም የተሻሻለ የጥራት መለኪያዎች ከማህደር ፎርማሊን-ቋሚ ፓራፊን-የተከተቱ የቲሹ ናሙናዎች፣ መርዛማ ሳይንሶች፣ ገጽ 17 እትም 73፣https://doi.org/10.1093/toxsci/