እኛ ልምድ ያለው አምራች ነበርን።ለትልቅ ቅናሽ በገቢያዋ ወሳኝ የእውቅና ማረጋገጫዎች ውስጥ አብዛኛዎቹን ማሸነፍ ቻይና ከፍተኛ ትብነት አንድ-ደረጃ ምርመራ Rt-Qpcrኪት V2 ፣ ጥራት ያለው የፋብሪካ ሕይወት ነው ፣ በደንበኛው ፍላጎት ላይ ያተኩሩ የኩባንያው ሕልውና እና ልማት ምንጭ ነው ፣ መምጣትዎን በጉጉት በመጠባበቅ በታማኝነት እና በታማኝነት የሥራ አመለካከትን እንከተላለን!
እኛ ልምድ ያለው አምራች ነበርን።በገበያው ወሳኝ የምስክር ወረቀቶች ውስጥ አብዛኛዎቹን ማሸነፍቻይና ታክ ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ, Qpcr, ኩባንያችን ቃል ገብቷል: ተመጣጣኝ ዋጋዎች, አጭር የምርት ጊዜ እና አጥጋቢ ከሽያጭ በኋላ አገልግሎት, በፈለጉት ጊዜ ፋብሪካችንን እንዲጎበኙ እንኳን ደህና መጡ.አሁን ደስ የሚል እና የረጅም ጊዜ ንግድ አብረን እንድንኖር እመኛለሁ !!!

መግለጫዎች

ይህ ኪት አር ኤን ኤን ከሰለጠኑ የሕዋስ ናሙናዎች ለ RT-qPCR ምላሾች በፍጥነት የሚለቀቅ ልዩ የሊሲስ ቋት ሲስተም ይጠቀማል፣ በዚህም ጊዜ የሚፈጅ እና አድካሚ የሆነውን የአር ኤን ኤ የመንጻት ሂደትን ያስወግዳል።የ RNA አብነት በ 7 ደቂቃዎች ውስጥ ብቻ ሊገኝ ይችላል.በመሳሪያው የቀረበው 5×Direct RT Mix እና 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagents የእውነተኛ ጊዜ የ PCR ውጤቶችን በፍጥነት እና በብቃት ሊያገኙ ይችላሉ።

5×Direct RT Mix እና 2×Direct qPCR Mix-SYBR ጠንካራ አጋዥ መቻቻል አላቸው፣እና የናሙናዎቹ lysate ለ RT-qPCR በቀጥታ አብነት ሆኖ ሊያገለግል ይችላል።ይህ ኪት ልዩ የሆነውን አር ኤን ኤ ከፍተኛ-ግንኙነት Foregene በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴዝ፣ እና Hot D-Taq DNA polymerase፣ dNTPs፣ MgCl ይዟል።₂፣ ምላሽ ቋት ፣ PCR አመቻች እና ማረጋጊያ።

ዝርዝሮች

200×20μl Rxns፣ 1000×20μl Rxns

Kit ክፍሎች

ባህሪዎች እና ጥቅሞች

∎ ቀላል እና ውጤታማ፡ በሴል ዳይሬክት RT ቴክኖሎጂ፣ የአር ኤን ኤ ናሙናዎችን በ7 ደቂቃ ውስጥ ማግኘት ይቻላል።

∎ የናሙና ፍላጎቱ ትንሽ ነው፣ እስከ 10 ህዋሶች መሞከር ስለሚቻል።

■ ከፍተኛ መጠን: በ 384, 96, 24, 12, 6-well plates ውስጥ በሰለጠኑ ሴሎች ውስጥ አር ኤን ኤ በፍጥነት መለየት ይችላል.

■ የዲኤንኤ ኢሬዘር የተለቀቁትን ጂኖም በፍጥነት ያስወግዳል፣በቀጣይ የሙከራ ውጤቶች ላይ ያለውን ተጽእኖ በእጅጉ ይቀንሳል።

∎ የተመቻቸ RT እና qPCR ስርዓት ባለ ሁለት ደረጃ RT-PCR በግልባጭ ግልባጭ ይበልጥ ቀልጣፋ እና PCR የበለጠ የተለየ እና የ RT-qPCR ምላሽ አጋቾችን የበለጠ የሚቋቋም ያደርገዋል።

Kit መተግበሪያ

የመተግበሪያው ወሰን: የሰለጠኑ ሴሎች.

- አር ኤን ኤ በናሙና ሊሲስ የተለቀቀ፡ ለዚህ ኪት RT-qPCR አብነት ብቻ ነው የሚመለከተው።

- ኪቱ ለሚከተሉት ዓላማዎች ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል፡ የጂን አገላለጽ ትንተና፣ በሲአርአና መካከለኛ የሆነ የጂን ጸጥታ ውጤት ማረጋገጥ፣ የመድኃኒት ማጣሪያ ወዘተ.

ሥዕላዊ መግለጫ

የማከማቻ እና የመደርደሪያ ሕይወት

የዚህ ኪት ክፍል I በ 4 ℃ ውስጥ መቀመጥ አለበት;ክፍል II በ -20 ℃ ውስጥ መቀመጥ አለበት.

Foregene Protease Plus II በ 4 ℃ ላይ መቀመጥ አለበት ፣በ -20 ℃ ላይ አይቀዘቅዝም።

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR በጨለማ -20℃ ላይ መቀመጥ አለበት።በተደጋጋሚ ጥቅም ላይ ከዋለ በ 4 ℃ ላይ ሊከማች ይችላል ለአጭር ጊዜ ማከማቻ (በ 10 ቀናት ውስጥ ጥቅም ላይ ይውላል) ። ልምድ ያለው አምራች ነበርን።Wining the majority in the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Quality is factory' life , በደንበኛው ፍላጎት ላይ ያተኩሩ የኩባንያው የህልውና እና የዕድገት ምንጭ ነው , We adhere to honesty and good faith working attitude, watching forward to your coming !
ትልቅ ቅናሽቻይና ታክ ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ, Qpcr, የእኛ ኩባንያ ቃል ገብቷል: ምክንያታዊ ዋጋዎች, አጭር የምርት ጊዜ እና አጥጋቢ ከሽያጭ በኋላ አገልግሎት, እኛ ደግሞ በፈለጉት ጊዜ የእኛን ፋብሪካ ለመጎብኘት አቀባበል.አሁን ደስ የሚል እና የረጅም ጊዜ ንግድ አብረን እንድንኖር እመኛለሁ !!!

QuickEአሲTM Cell Direct RT-qPCR Kit -ታከምan

ድመት ቁጥር DRT-01021/01022

ለሕዋስ ቀጥታ RT-qPCR ≤ 1000,000 ሴሎችን በመጠቀም

የምርት መግቢያ

ይህ ምርት ጊዜ የሚፈጅ እና አድካሚ አር ኤን ኤ የመንጻት ሂደትን በማስወገድ አር ኤን ኤ ኤን ኤን በፍጥነት ለመልቀቅ ከሰለጠኑ የሕዋስ ናሙናዎች ለ RT-qPCR ምላሽ ልዩ የሆነ የሊሲስ ማቋቋሚያ ዘዴን ይጠቀማል እና አስፈላጊውን የአር ኤን ኤ አብነት ለማግኘት 7 ደቂቃ ብቻ ነው፣ በ 5× Direct RT Mix፣ 2× Direct qPCR Mix-Taqman በመሳሪያው የቀረበው 2× Direct qPCR Mix-Taqman በፍጥነት እና በተቀላጠፈ PCR-time ውጤት ማግኘት ይችላል።

5× Direct RT Mix እና 2× Direct qPCR Mix-Taqman ጠንካራ አጋዥ መቻቻል አላቸው እና እንደ አብነት የሚለካውን የናሙናውን lysate በመጠቀም ቀልጣፋ መገለባበጥ እና የተለየ ማጉላት ይችላሉ።ሬጀንቱ Foregene Reverse Transcriptase፣ Hot D-Taq DNA Polymerase፣ dNTPs፣ MgCl ይዟል።₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer እና Stabilizer, ይህም በፍጥነት እና በቀላሉ ናሙናዎችን ለመለየት lysis ቋት ጋር ጥቅም ላይ ሊውል የሚችል, እና ከፍተኛ ትብነት, specificity እና መረጋጋት ባህሪያት አሉት.

የምርት ባህሪያት

የአር ኤን ኤ ናሙናዎችን ለማግኘት እስከ 7 ደቂቃ የሚፈጅ ቀላል፣ ውጤታማ የሴል ቀጥታ RT ቴክኖሎጂ።

የናሙና መስፈርቶች ትንሽ ናቸው፣ እና ቢያንስ 10 የሰለጠኑ ህዋሶች ለሙከራ ጥቅም ላይ ሊውሉ ይችላሉ።

እንደ 384፣ 96፣ 24፣ 12 እና 6-well plates ያሉ የሰለጠኑ ህዋሶችን ለአር ኤን ኤ በፍጥነት ለማግኘት ከፍተኛ ውጤት።

የዲኤንኤ ኢሬዘር የተለቀቁትን ጂኖም በፍጥነት ማስወገድ ይችላል, ይህም በሚቀጥሉት የሙከራ ውጤቶች ላይ ያለውን ተጽእኖ በእጅጉ ይቀንሳል.

የተመቻቹ የ RT እና qPCR ስርዓቶች ባለ ሁለት ደረጃ RT-PCR ይበልጥ ቀልጣፋ የተገላቢጦሽ ግልባጭ፣ ልዩነት እና ጠንካራ የ RT-qPCR ምላሽ አጋቾች መቻቻልን ያነቃሉ።

Kit መተግበሪያ

የመተግበሪያው ወሰን: የሰለጠኑ ሴሎች.

ናሙና ትንተና አር ኤን ኤ ተተርጉሟል፡ እንደ ባለ ሁለት ደረጃ RT-qPCR አብነት ብቻ ጥቅም ላይ ይውላል።

ኪትስ ለሚከተሉት ዓላማዎች ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል-የጂን ቁጥጥር መግለጫ ትንተና, የ allele test, የመድኃኒት ማጣሪያ, ወዘተ.

የኪት ገደቦች

የተጨመሩ ቁርጥራጮች ≤ 300 ቢፒ.

ኪትስ አዲስ የባህል ሴሎችን ለመሥራት ያገለግላል።

የምርት ጥራት ቁጥጥር

እንደ FOREGENE አጠቃላይ የጥራት አስተዳደር ሥርዓት እያንዳንዱ የሴል ዳይሬክት RT-qPCR ተከታታይ ኪቶች የእያንዳንዱን ስብስብ ጥራት አስተማማኝነት እና መረጋጋት ለማረጋገጥ ብዙ ጊዜ በጥብቅ ይሞከራሉ።

የኪት ይዘቶች

*:Cell Lysis፣ 5×Direct RT Mix፣ 2× Direct qPCR Mix-Taqman ለየብቻ ሊገዛ ይችላል፣ዝርዝሩ በአባሪ 1 (ገጽ 13) ቀርቧል።

የማከማቻ ሁኔታዎች

1. የማጓጓዣ ሁኔታዎች

አነስተኛ የሙቀት መጠን ያለው የበረዶ እሽግ ማጓጓዣ አጠቃላይ ሂደት, ኪቱ በ <4 ° ሴ ሁኔታ ውስጥ መሆኑን ለማረጋገጥ.

2. የማከማቻ ሁኔታዎች

ክፍል አንድን በ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና ክፍል II በ -20 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ያከማቹ።

የ Foregene Protease Plus II በ 4 ° ሴ ውስጥ መቀመጥ አለበት, በ -20 ° ሴ.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman በ -20°ሴ፣ ወይም በተደጋጋሚ ጥቅም ላይ ከዋለ በ4°ሴ ለአጭር ጊዜ አገልግሎት (በ10 ቀናት ውስጥ) ይከማቻል።

የኪት አካል መረጃ

ቋት CL፡ ለሴል ሊስሲስ ምላሽ የሚያስፈልገውን አካባቢ ያቀርባል።

ቋት ST: በሚቀጥለው RT ላይ ተጽእኖዎችን ለማስወገድ በሊዛት ውስጥ ያለውን ንቁ ንጥረ ነገር ያጠፋል.

ዲ ኤን ኤ ኢሬዘር፡ ዲኤንኤ ማስወገጃ፣ በሚቀጥሉት ሙከራዎች ላይ ጂኖም የማስወገድ ውጤት።

5× ቀጥተኛ RT ድብልቅ፡ ከፍተኛ የአር ኤን ኤ ተዛማጅነት Foregene Reverse Transcriptase፣ RNase Inhibitor፣ dNTPs፣ stabilizers፣ enhancers፣ optimizers፣ እና በግልባጭ የጽሑፍ ቅጂዎች ለተመቻቸ አሰላለፍ (Random Primer፣ Oligo(dT) ይዟል።₁₈ዋና)።

Foregene Protease Plus II፡ በሊሲስ ቋት አውድ ውስጥ፣ ሴሎች ኑክሊክ አሲዶችን ለመልቀቅ lysed ናቸው።

2× ቀጥተኛ qPCR ሚክስ-ታክማን፡ ይህ ሬጀንት ትኩስ ዲ-ታክ ዲኤንኤ ፖሊመሬሴን፣ ዲኤንቲፒን፣ MgClን ይዟል።₂፣ ምላሽ ቋት ፣ PCR አመቻች እና ማረጋጊያ።

20× ROX ማመሳከሪያ ዳይ፡ በአጠቃላይ በሪል ታይም PCR የ ABI፣ Stratagene እና ሌሎች ኩባንያዎች ላይ ጥቅም ላይ የሚውለው በ PCR ቱቦዎች እና ቱቦዎች መካከል ያለውን ልዩነት ለማስተካከል በፒሲአር አወሳሰን ስህተት ነው።ለተለያዩ መሳሪያዎች የሚያስፈልገው 20× ROX ማመሳከሪያ ዳይ ትኩረት የተለያየ ነው፣ እና ተጠቃሚው በተመከረው የመሳሪያው ክምችት መሰረት ሊጨምር ይችላል።

RNase-ነጻ ddH₂ኦ፡- ከ RNase-ነጻ sterilized ultra pure water ለሁለት-ደረጃ RT-qPCR ምላሽ።

ቅድመ ጥንቃቄዎች:(ጥቅሉን ከመጠቀምዎ በፊት ጥንቃቄዎችን በጥንቃቄ ማንበብዎን እርግጠኛ ይሁኑ)

በናሙናዎች መካከል መበከልን ለማስወገድ ለሙከራው የአሠራር ዘዴ ትኩረት ይስጡ.

የ RNase ብክለትን እና የአር ኤን ኤ መበላሸትን ለማስወገድ ለሙከራ አካባቢ እና እቃዎች ንጽህና ትኩረት ይስጡ.

ትኩስ ወይም በደንብ የተጠበቁ የሕዋስ ናሙናዎችን ይውሰዱ እና ተደጋጋሚ የቀዘቀዙ የሕዋስ ናሙናዎችን በጭራሽ አይጠቀሙ።

5× Direct qPCR Mix፣2× Direct qPCR Mix-Taqman ተደጋጋሚ ቅዝቃዜን ከመቅለጥ መቆጠብ አለበት፣ይህ ካልሆነ ግን በግልባጭ የጽሁፍ ግልባጭ እና PCR ቅልጥፍናን ይነካል።

መሰናዶራሽንከዚህ በፊትክወና

ይህንን ኪት ከመጠቀምዎ በፊት መመሪያዎቹን በጥንቃቄ ማንበብዎን እርግጠኛ ይሁኑ.የሴል ዳይሬክት RT-qPCR ኪት ቀላል፣ ምቹ እና ለመስራት ፈጣን ነው፣ እና መመሪያው ስለ አጠቃላይ ኪቱ እና እንዴት በትክክል መጠቀም እንደሚቻል የተሟላ መረጃ ይሰጣል።እባክዎ ከመጠቀምዎ በፊት አስፈላጊዎቹን የሙከራ ቁሳቁሶች እና መሳሪያዎች ያዘጋጁ።

የሙከራ ቁሳቁሶች እና መሳሪያዎች

◆ የባህል ሴሎች.

◆ 1.5 ml ወይም 2 ml፣ RNase-/DNase-Free centrifuge tube፣ RNase-/DNase-ነጻ ጫፍ፣ 0.2 ml የጸዳ qPCR ቱቦ።

◆ qPCR ማሽን፣ pipette፣ tabletop centrifuge (≥13,400×ሰ) (በሙከራ ፍላጎቶች ላይ በመመስረት) ወዘተ.

ደህንነት

◆ ይህ ምርት ለሳይንሳዊ ምርምር ዓላማዎች ብቻ ነው, እባክዎን ለመድኃኒት, ክሊኒካዊ, ለምግብ እና ለመዋቢያነት ዓላማዎች አይጠቀሙበት.

◆ ኬሚካሎችን በሚጠቀሙበት ጊዜ ተስማሚ የላብራቶሪ ልብሶችን፣ ጓንቶች፣ መከላከያ መነጽሮች ወዘተ ያድርጉ።

ኦፕሬሽንመመሪያዎች

የሴል ሊሲስ ሲስተሞች፣ RT ሲስተሞች እና የqPCR ምላሽ ማሟያ ማሟያ ጥቅሎችን በአባሪ 1 (ገጽ 13) ላይ ለዝርዝሮች ለየብቻ ሊገዙ ይችላሉ።

የአሠራር መመሪያ

መ፡ ናሙና አር ኤን ኤ መለቀቅ

1.ሴሎች ቀድመው ተወስደዋል፡ የሕዋስ ባሕልን ሳህኑን በቀዝቃዛ ፒቢኤስ ያጠቡ፣ ከዚያም ሴሎቹን ይቅቡት (10-10)⁶), 10⁶ ከሴሎች ብዛት ይልቅ ለኤንኤን ለማውጣት እና ለማጣራት ሴል እና አር ኤን ኤ ማግለል ስብስብ (DE-03111) ወይም Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) Foregene ይመከራል።

1.1.የተጣበቁ ሴሎች (24- ጉድጓድ ሳህን እንደ ምሳሌ)

1.1.1.በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ ያሉትን የሴሎች ብዛት ይወስኑ, የሴሎች ብዛት 1 × 10 መሆኑን ይወስኑ⁵, እና ከባህላዊው ምግብ ውስጥ የባህል ማእከሉን ለማስወገድ pipette ይጠቀሙ.

1.1.2.በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 200 ሚሊ ቀድሞ የቀዘቀዘ 1 × PBS ይጨምሩ።ፓይፕ በተደጋጋሚ አታድርጉ እና ፒቢኤስን ከጉድጓድ ውስጥ ያስወግዱ.ሳህኑን ያዙሩት እና በተቻለ መጠን PBS ያስወግዱ።ወደ ደረጃ 2 ይቀጥሉ።

1.1.3.የተለየ የሕዋስ ባህል ምግብ ወይም የማጣቀሻ ቁጥር ሠንጠረዥ 1-1 በሴል ባህል ምግብ ውስጥ አስቀድሞ የቀዘቀዘ 1 × PBS ለሴል ማጠቢያ ተጨምሯል።

ሠንጠረዥ1-1፡ ለተለያዩ የሕዋስ ቁጥሮች የPBS መጠን

ማስታወሻ፦ጠንካራ ተጣባቂ ሴሎችን ለማረጋገጥ,በሚታጠብበት ጊዜ ከፍተኛ ቁጥር ያለው የሕዋስ መጥፋት .

1.2.ተንጠልጣይ ህዋሶች ወይም ተለጣፊ ህዋሶች በማይቦረቦሩ ሳህኖች ውስጥ የሰለጠኑ

1.2.1.ብዙ ጉድጓድ ባልሆኑ ሳህኖች ውስጥ የሰለጠኑ ተጣባቂ ሕዋሳት (የተንጠለጠሉ ሴሎች ከሚቀጥለው ደረጃ 1.2.2 ይጀምራሉ) ፣ በተለመደው የሕዋስ አሰባሰብ ዘዴ መሠረት ሴሎችን ሰብስበው ይለያዩ እና በባህላዊ ሳህን ወይም ሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ ያስቀምጧቸዋል ።ትራይፕሲንናይዜሽን ጥቅም ላይ ከዋለ ሴሎቹን ለመሰብሰብ እና ቀሪውን ትራይፕሲን ለማስወገድ ሴንትሪፍጋሽን ያስፈልገዋል ሲል ፒቢኤስ እንደገና የተንጠለጠሉ ህዋሶችን ወደ ግለሰባዊ ህዋሶች ጨምሯል።

1.2.2.የሴሎች ብዛት ከተቆጠረ በኋላ፣ የተቆራረጡ ሴሎች 1×10⁵ አንድ ወደ ሴንትሪፉጅ ቱቦዎች፣ ሴሎችን በሴንትሪፍግሽን በ 1000 × g ለ 10 ደቂቃ ይሰብስቡ።

1.2.3.ወደ ሴንትሪፉጅ ቱቦ 200 μl PBS ን ይጨምሩ, ደጋግመው የቧንቧ መስመር አያድርጉ እና በቀጥታ ፒ.ቢ.ኤስ.ወደ ደረጃ 2 ቀጥል (ለመዝነቡ አስቸጋሪ ከሆነ እና ሴሎቹ እንደገና እንዲታቀቡ ከተደረጉ, ከፍተኛውን ከተጣለ በኋላ በ 1000×g ሴንትሪፉድ 10 ደቂቃ ሊከናወን ይችላል, የሴሉ እንክብሉ ወደ ደረጃ 2 ይቀጥላል)

2.Cell lysis: አስወግድ Buffer CL, የሙቀት መጠኑ ከክፍል ሙቀት, ዲ ኤን ኤ ኢሬዘር እና ፎሬጂን ፕሮቲሴስ ፕላስ II ጋር, በሚከተለው ሰንጠረዥ 1-2 የተዘጋጀ የሊሲስ ስርዓት: (የሊሲስ መፍትሄ ለአገልግሎት ዝግጁ ነው).

ሠንጠረዥ 1-2: መሰንጠቅ የስርዓት ዝግጅት (ማስታወሻ: በበረዶ ላይ ዝግጅት ላይ)

3.(24 -well plate as a example) Pipette 200 μl የሴል ሊሲስ ማስተር ቅልቅል በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ, ደጋግሞ 5-10 ጊዜ ይንፉ, በክፍል ሙቀት (20-25 ℃) ለ 5 ደቂቃዎች ይጨምሩ.

ማስታወሻ፦አረፋ እንዳይፈጠር፣ እባክዎን የ pipetting pipette ሚዛን ወደ 200μl ወይም ከዚያ በታች ሲስተካከል።ሴሎቹ ከሊሲስ በኋላ ደመናማ ሊመስሉ ይችላሉ, ይህም የተለመደ ነው.

4. (24 -ዌል ሳህን እንደ ምሳሌ) በፈሳሽ ውስጥ ተጨምሯል 20 μl Buffer ST (የተለያዩ የ lysis systems Buffer ST በሠንጠረዥ 1-3 ላይ በሚታየው መጠን ተጨምሯል) ፣ ተደጋጋሚ የቧንቧ ዝርግ 5-10 ጊዜ ፣ ​​በክፍል ሙቀት (20-25 ℃) ለ 2 ደቂቃዎች ተጨምረዋል ።

ማስታወሻ፦የሊዛው መጨመሩን የሚያረጋግጥ የፓይፕ ጫፍ ከመሬት በታች ይጣላል,አረፋዎች እንዳይፈጠሩ ለመከላከል እባክዎን የ pipette pipette ሚዛን ወደ 200μl ወይም ከዚያ በታች ሲስተካከል።

ሠንጠረዥ 1-3፦ቋት ST ያክሉ

5.The lysate ለቀጣይ የ RT-qPCR ሙከራዎች ጥቅም ላይ ይውላል.ተከታዩ ሙከራዎች በጊዜ ውስጥ ሊከናወኑ ካልቻሉ፣ እባክዎን በበረዶ ላይ ከ 2 ሰዓት በላይ ያቆዩት እና በ -20 ℃ ወይም -80 ℃ (ከሦስት ወር ያልበለጠ) ያከማቹ።

ለ: RT ስርዓት ዝግጅት

1.Take 5 × Direct RT Mix እና በበረዶ መታጠቢያ ላይ ያስቀምጡት, በተፈጥሮው ይቀልጡት, እና በኋላ ላይ ጥቅም ላይ እንዲውል በቀስታ ይቀላቅሉ;ከ RNase-Free ddH2O አውጥተው ቀልጠው ለበኋላ ጥቅም ላይ እንዲውል በበረዶ መታጠቢያ ላይ ያስቀምጡት።ከታች ባለው ሠንጠረዥ 2-1 መሰረት የምላሽ ስርዓቱን በበረዶ ላይ ያዘጋጁ.

ሠንጠረዥ 2-1: RT ምላሽ ሥርዓት ዝግጅት

2.የስርዓት አቀነባበርን ከጨረሱ በኋላ በሚከተለው ሠንጠረዥ ውስጥ በቀስታ የተቀላቀለ እና በአጭር ጊዜ ውስጥ ያተኮሩ 2 -2 ምላሽ ሁኔታዎች RT ምላሽ።

ሠንጠረዥ 2-2: RT ምላሽ ሁኔታ ቅንብር

3.ምላሹን ከጨረሰ በኋላ, የምላሽ ምርቱ በቀጥታ ለ qPCR በበረዶ ላይ ተቀምጧል, እባክዎን የረጅም ጊዜ ጥበቃን -20 ℃ ወይም -80 ℃ ያስቀምጡ.

ማሳሰቢያ፡-ያልጸዳ አብነት አጠቃቀም ምክንያት በተገላቢጦሽ ግልባጭ ምርት ላይ ነጭ ዝናቦች ሊታዩ ይችላሉ።ይህ የተለመደ ክስተት ነው።ለተከታታይ ሙከራዎች ወዲያውኑ ከፍተኛውን ሴንትሪፉድ ያድርጉ።

የተገኘው የ RT ምላሽ መፍትሄ በሚቀጥለው ደረጃ የሪል ታይም PCR ምላሽ ስርዓቶች ላይ ተጨምሯል, ከ10-30% የምላሽ ስርዓት መጠን ለመጨመር ይመከራል.

C: qPCR ምላሽ ሥርዓት ዝግጅት

1.በደረጃ ሲዲኤንኤ አብነት የተዘጋጀ ተገቢ መጠን B በሚከተለው ሠንጠረዥ 3-1 ምላሽ ሥርዓት ለማዘጋጀት.

ማስታወሻ፡ የሲዲኤንኤ አብነት መጠን ከ10-30% የqPCR ስርዓትን ይይዛል።ለምሳሌ, በ 20μl qPCR ስርዓት ውስጥ, 2-6 μl የሊሲስ መያዣን ይጨምሩ, ነገር ግን ከ 6 μl አይበልጥም.

2.The ማመቻቸት ጥሩ qPCR ሁኔታዎች (Annealing ሙቀት, ወዘተ) ለ qPCR ምላሽ (በሠንጠረዥ 3-2 ላይ የተሰጠው ምላሽ ሁኔታዎች).

ማስታወሻ፡ የተሻለ ውጤት ለማግኘት ለqPCR ምላሽ የተመቻቹ ሁኔታዎችን ለመጠቀም ይሞክሩ።

ሠንጠረዥ 3-1: PCR ምላሽ ሥርዓት ዝግጅት

1 *: የፕሪመር አጸፋዊ አፈፃፀም ደካማ በሚሆንበት ጊዜ በ 50-900 nM ውስጥ የፕሪመር ትኩረትን ማስተካከል ይቻላል.

ማሳሰቢያ፡ የqPCR ስርዓት እንደ የሙከራ ፍላጎቶች እና የፍሎረሰንት ሳይክል ሞዴል ሊስተካከል ይችላል።ለqPCR በ50μl ስርዓት ፣ በ 20 መሠረት የ reagent መጠንን በተመጣጣኝ መጠን ያስተካክሉμl ስርዓት.

2*: በፍሎረሰንት መጠናዊ ቴርማል ሳይክለር መሰረት ተገቢውን የ ROX ማጣቀሻ ማቅለሚያ የመጨረሻ ትኩረትን ይምረጡ።ለተለመደው የፍሎረሰንት መጠናዊ ሳይክሎች በጣም ተገቢው የ ROX ማጣቀሻ ማቅለሚያ ክምችት ከዚህ በታች ባለው ሠንጠረዥ ውስጥ ይታያል።

ሠንጠረዥ 3-2፡ የqPCR ምላሽ ሁኔታዎች ቀርበዋል።

ማሳሰቢያ፡ ምርጡን የqPCR ውጤት ለማግኘት የግራዲየንት PCR ለተለያዩ አብነቶች እና ለተለያዩ ፕሪምሮች የምላሽ ሁኔታዎችን ለማመቻቸት ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል።PCR ምላሽ ሁኔታዎች ፍሎረሰንስ analyzer, አብነት, primer, ወዘተ ላይ በመመስረት የተለየ ክወና ውስጥ, ለተመቻቸ ምላሽ ሁኔታዎች ፍሎረscence መጠናዊ አማቂ cycler, አብነት አይነት, ፍላጎት ቁርጥራጭ መጠን, መሠረት ቅደም ተከተል አምፕሊፋይድ ቁራጭ እና GC ይዘት እና primers, ምላሽ ጨምሮ የሙቀት መጠን ርዝመት, የሙቀት መጠንን ጨምሮ.

የእውነተኛ ጊዜ PCR ፕሪመር ንድፍ መርሆዎች

ወደፊት ፕሪመር እና የተገላቢጦሽ ፕሪመር

ለሪል ታይም PCR, የፕሪመር ንድፍ በጣም አስፈላጊ ነው.ፕሪመርሮች ከ PCR ማጉላት ልዩነት እና ቅልጥፍና ጋር የተገናኙ ናቸው፣ እና የሚከተሉትን መርሆች በማጣቀስ ሊነደፉ ይችላሉ።

◆ የመነሻ ርዝመት: 18-30bp.

◆ የጂሲ ይዘት፡ 40-60%.

◆ Tm ዋጋ፡- እንደ ፕሪመር 5 ያሉ የፕሪመር ዲዛይን ሶፍትዌር የፕሪመርን ቲም ዋጋ ሊሰጡ ይችላሉ።የላይ እና የታችኛው ተፋሰሶች የቲኤም እሴቶች በተቻለ መጠን ቅርብ መሆን አለባቸው።የቲም ስሌት ቀመርም ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል፡ Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T)።PCR ን ሲያከናውን ከ 5 ዲግሪ ሴንቲግሬድ የፕሪመር ቲም እሴት በታች ያለው የሙቀት መጠን በአጠቃላይ እንደ ማደንዘዣ የሙቀት መጠን ይመረጣል (ተዛማጁ የሙቀት መጠን መጨመር የ PCR ምላሽን ልዩነት ሊጨምር ይችላል).

◆ ፕሪመርስ እና PCR ምርቶች፡-

◆ የንድፍ ፕሪመር PCR ማጉላት የምርት ርዝመት ከ100-150ቢፒ ይመረጣል።

◆ የአብነት ሁለተኛ መዋቅራዊ አካባቢ ውስጥ ንድፍ primers በተቻለ መጠን መወገድ አለበት.

◆ 2 ወይም ከዚያ በላይ ተጓዳኝ መሠረቶች በ3′ የላይኛው እና የታችኛው ተፋሰስ ፕሪመር መካከል እንዳይፈጠሩ።

◆ ፕሪመር 3′ ተርሚናል ቤዝ ከ 3 ተጨማሪ ተከታታይ G ወይም C ጋር ሊኖር አይችልም።

◆ ፕራይመሮቹ እራሳቸው ተጨማሪ መዋቅሮች ሊኖራቸው አይችልም, አለበለዚያ የፀጉር አሠራር ይሠራል, የ PCR ማጉላት ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል.

◆ ATCG በተቻለ መጠን በፕሪመር ቅደም ተከተል መሰራጨት አለበት እና የ 3′ ተርሚናል ቤዝ እንደ ቲ መወገድ አለበት።

አባሪ1፦Cኤል ዳይሬክትRT-qPCR Kit component ማሟያ ጥቅል

1.የሴል ሊሲስ መፍትሄ