የ pipette ምክሮችን እና የ EP ቱቦዎችን ማምከን, ወዘተ.

1. 0.1% (አንድ ሺህ) DEPC (በጣም መርዛማ ንጥረ ነገር) በዲዮኒዝድ ውሃ ማዘጋጀት, በጢስ ማውጫ ውስጥ በጥንቃቄ ይጠቀሙ እና ከብርሃን በ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ያስቀምጡት;

DEPC ውሃ በ DEPC የታከመ እና በከፍተኛ ሙቀት እና ከፍተኛ ግፊት የጸዳ ንጹህ ውሃ ነው።ከ RNase፣ DNase እና proteinase ነፃ ለመሆን ተፈትኗል።

2. የ pipette ጫፍ እና የ EP ቱቦ ወደ 0.1% DEPC ያስቀምጡ, እና የ pipette ጫፍ እና EP ቱቦ በ 0.1% DEP መሞላቱን ያረጋግጡ.

3. ከብርሃን ይከላከሉ ፣ ይቁሙ ፣ በአንድ ሌሊት (12-24 ሰ)

4. የጫፍ እና የ EP ቱቦን የያዘው ሳጥን በ DEPC ውስጥ መጨመር አያስፈልግም.የ DEPC ውሃን በጫፍ ወይም በ EP ቱቦ ውስጥ ካስወገዱ በኋላ ያሽጉትና ያሽጉት።

5. 121 ዲግሪ ሴልሺየስ፣ 30 ደቂቃ

6. 180 ዲግሪ ሴልሺየስ, ለብዙ ሰዓታት (ቢያንስ 3 ሰዓታት) ደረቅ.

ማስታወሻ፡- ሀ.DEPC በሚይዙበት ጊዜ የላስቲክ ጓንቶች እና ጭንብል ያድርጉ!ለ፣ ወይም ያለ DEPC ማምከን፣ 130 ℃፣ 90min autoclave (ብዙ ላቦራቶሪዎች ከፍተኛ የሙቀት መጠን ማምከን ሁለት ጊዜ)

አር ኤን ኤ ማውጣት ግምት

የቲሹ አር ኤን ኤ ማግለል ውድቀት ሁለት ዋና ዋና ክስተቶች

አር ኤን ኤ መበላሸት እና በቲሹዎች ውስጥ ያሉ ቆሻሻዎች ቅሪቶች ፣መበላሸትን በተመለከተ በመጀመሪያ አር ኤን ኤ ከሰለጠኑ ህዋሶች የሚወጣው ለምንድነው በቀላሉ የማይበሰብስበትን እንይ።አሁን ያሉት አር ኤን ኤ ማውጣት ሪጀንቶች ሁሉም RNaseን በፍጥነት የሚገቱ አካላትን ይይዛሉ።ሊዛን ወደ ባሕል ሴሎች ውስጥ ይጨምሩ እና በቀላሉ ይቀላቀሉ, ሁሉም ሴሎች ከሊዛት ጋር በደንብ ሊደባለቁ ይችላሉ, እና ሴሎቹ ሙሉ በሙሉ ይጣላሉ.ሴሎቹ ከተቀቡ በኋላ በሊዛት ውስጥ ያሉት ንቁ ንጥረ ነገሮች ኢንትሮሴሉላር RNase ን ይከላከላሉ, ስለዚህ አር ኤን ኤ ሳይበላሽ ይቆያል.ያም ማለት, የሰለጠኑ ሴሎች በቀላሉ እና ሙሉ በሙሉ ከሊዛት ጋር ስለሚገናኙ, አር ኤን ኤ በቀላሉ አይበላሽም;በሌላ በኩል ደግሞ በቲሹ ውስጥ ያለው አር ኤን ኤ በቀላሉ ሊበላሽ ይችላል ምክንያቱም በቲሹ ውስጥ ያሉት ሴሎች ከሊዛት ጋር በፍጥነት ለመገናኘት ቀላል አይደሉም.በቂ ግንኙነት ምክንያት.ስለዚህ፣የአር ኤን ኤ እንቅስቃሴን በሚገታበት ጊዜ ቲሹን ወደ አንድ ሕዋስ የሚቀይርበት መንገድ እንዳለ በማሰብ የመበስበስ ችግር ሙሉ በሙሉ ሊፈታ ይችላል።

እንዲህ ዓይነቱ ዘዴ በጣም ውጤታማ የሆነው ፈሳሽ ናይትሮጅን መፍጨት ነው.ይሁን እንጂ የፈሳሽ ናይትሮጅን መፍጨት ዘዴ በጣም አስጨናቂ ነው, በተለይም የናሙናዎች ብዛት ትልቅ ከሆነ.ይህ የሚቀጥለውን ምርጥ ነገር አስገኝቷል- homogenizer.የhomogenizerዘዴው ሴሎች ከሊዛት ጋር ከመገናኘታቸው በፊት የ RNase እንቅስቃሴ እንዴት እንደሚታገድ ጥያቄን ከግምት ውስጥ አያስገባም ፣ ይልቁንም የሕብረ ሕዋሳት መቆራረጥ ፍጥነት RN ን ከሚቀንስበት ፍጥነት የበለጠ እንዲጸልይ ይጸልያል።

የኤሌክትሪክ homogenizer ውጤት የተሻለ ነው,እና የብርጭቆ homogenizer ውጤት ደካማ ነው, ነገር ግን በአጠቃላይ, homogenizer ዘዴ የመበስበስ ክስተት ለመከላከል አይችልም.ስለዚህ, የማውጣት ተበላሽቷል ከሆነ, የመጀመሪያው የኤሌክትሪክ homogenizer ፈሳሽ ናይትሮጅን ጋር መፍጨት ጥቅም ላይ መዋል አለበት;የመነሻ መስታወት ሆሞጅንናይዘር ወደ ኤሌክትሪክ ግብረ ሰዶማዊነት መቀየር ወይም በቀጥታ በፈሳሽ ናይትሮጅን መፍጨት አለበት።ችግሩ ወደ 100% ሊደርስ የሚችል ነው።መፍትሔ አግኝ።

በቀጣዮቹ ሙከራዎች ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድረው የንጽሕና ቅሪት ችግር ከመበስበስ ይልቅ የተለያዩ ምክንያቶች አሉት, እና መፍትሄዎች በተመሳሳይ መልኩ የተለያዩ ናቸው.በማጠቃለል,በቲሹ ውስጥ መበላሸት ወይም ቀሪ ቆሻሻዎች ካሉ ለተወሰነው የሙከራ ቁሳቁስ የማስወጫ ዘዴ / ሬጀንት ማመቻቸት አለበት።የእርስዎን ውድ ናሙናዎች ለማመቻቸት መጠቀም የለብዎትም፡ እንደ አሳ/ዶሮ ያሉ ትናንሽ እንስሳትን ከገበያ መግዛት፣ለአር ኤን ኤ ለማውጣት የቁሳቁስን ተዛማጅ ክፍል መውሰድ እና ሌላውን ክፍል ለፕሮቲን ማውጣት -በአፍ፣በጨጓራ እና በአንጀት መፍጨት።

የተወሰደው አር ኤን ኤ ዒላማው አር ኤን ኤ ለተለያዩ ተከታታይ ሙከራዎች ጥቅም ላይ ይውላል፣ እና የጥራት መስፈርቶች የተለያዩ ናቸው።

የሲዲኤንኤ ቤተ መፃህፍት ግንባታ የኢንዛይም ምላሽ አጋቾቹ ሳይቀሩ የአር ኤን ኤ ታማኝነትን ይፈልጋል።ሰሜናዊው ከፍተኛ የአር ኤን ኤ ታማኝነት እና የኢንዛይም ምላሽ አጋቾች ቅሪቶች ዝቅተኛ መስፈርቶችን ይፈልጋል።RT-PCR በጣም ከፍተኛ የአር ኤን ኤ ትክክለኛነትን አይፈልግም ፣ነገር ግን የኢንዛይም ምላሽን ይከለክላል.የተቀሩት መስፈርቶች ጥብቅ ናቸው.ግቤት ውጤቱን ይወስናል;ግቡ ከፍተኛውን የንፅህና አር ኤን ኤ ማግኘት በሆነ ጊዜ ሁሉ ህዝብን እና ገንዘብን ያስወጣል።

የናሙናዎች ስብስብ/ማከማቻ

መበስበስን የሚነኩ ምክንያቶች ናሙናው ሕያው አካልን/ወይም የመጀመሪያውን የእድገት አካባቢን ከለቀቀ በኋላ፣ በናሙናው ውስጥ ያሉት ኢንዛይሞች አር ኤን ኤ ማዳከም ይጀምራሉ።እና የመበላሸቱ መጠን ከውስጣዊ ኢንዛይሞች እና የሙቀት መጠን ጋር የተያያዘ ነው.በባህላዊው, የኢንዛይም እንቅስቃሴን ሙሉ በሙሉ ለመግታት ሁለት መንገዶች ብቻ አሉ-ሊዛትን ወዲያውኑ ይጨምሩ እና በደንብ እና በፍጥነት ተመሳሳይነት;ወደ ትናንሽ ቁርጥራጮች ይቁረጡ እና ወዲያውኑ በፈሳሽ ናይትሮጅን ውስጥ ያቀዘቅዙ።ሁለቱም ዘዴዎች ፈጣን ቀዶ ጥገና ያስፈልጋቸዋል.የኋለኛው ለሁሉም ናሙናዎች ተስማሚ ነው ፣ የመጀመሪያው ግን ዝቅተኛ የሴሎች ይዘት እና ውስጣዊ ኢንዛይሞች ላላቸው ሕብረ ሕዋሳት ብቻ ተስማሚ እና በቀላሉ ተመሳሳይነት ያለው ነው።በተለይም የእፅዋት ቲሹ፣ ጉበት፣ ቲማስ፣ ቆሽት፣ ስፕሊን፣ አንጎል፣ ስብ፣ የጡንቻ ቲሹ ወዘተ ከመቀጠልዎ በፊት በፈሳሽ ናይትሮጅን ይቀዘቅዛሉ።

የናሙናዎች መከፋፈል እና ተመሳሳይነት

ማሽቆልቆልን እና ምርትን የሚነኩ ምክንያቶች ናሙና መከፋፈል ነው።ለተሟላ ግብረ-ሰዶማዊነት, ይህም ሙሉ እና ሙሉ አር ኤን ኤ እንዲለቀቅ ነው.ሴሎች ሳይሰበሩ በቀጥታ ተመሳሳይነት ሊኖራቸው ይችላል.ቲሹዎች ከተሰበሩ በኋላ ብቻ ሊዋሃዱ ይችላሉ.እርሾ እና ባክቴሪያዎች ተመሳሳይነት ከመፈጠሩ በፊት በተዛማጅ ኢንዛይሞች መሰባበር አለባቸው።ዝቅተኛ ኢንዛይም ይዘት እና ቀላል homogenization ጋር ቲሹ አንድ homogenizer በ lysate ውስጥ በአንድ ጊዜ መፍጨት እና homogenized ይቻላል;የእፅዋት ቲሹ ፣ ጉበት ፣ ታይምስ ፣ ቆሽት ፣ ስፕሊን ፣ አንጎል ፣ ስብ ፣ የጡንቻ ሕብረ ሕዋስ እና ሌሎች ናሙናዎች ፣ በውስጣቸው ከፍተኛ ኢንዛይሞች አላቸው ወይም በቀላሉ ተመሳሳይነት የላቸውም ፣ስለዚህ የሕብረ ሕዋሳት መቋረጥ እና ግብረ-ሰዶማዊነት በተናጠል መከናወን አለባቸው.እጅግ በጣም አስተማማኝ እና በጣም ውጤታማ የሆነው የመከፋፈል ዘዴ በፈሳሽ ናይትሮጅን መፍጨት ነው, እና በጣም አስተማማኝ የሆነው ግብረ-ሰዶማዊነት ዘዴ የኤሌክትሪክ homogenizer ነው.በፈሳሽ ናይትሮጅን ስለ መፍጨት ልዩ ማስታወሻ፡ በጠቅላላው የወፍጮ ሂደት ውስጥ ናሙናው መቅለጥ የለበትም፣ ምክንያቱም ውስጣዊ ኢንዛይሞች በሚቀዘቅዙበት ጊዜ የሚሰሩ ናቸው።

የ lysate ምርጫ

የሥራውን ምቾት እና የተረፈውን ውስጣዊ ቆሻሻዎች መንስኤዎች ላይ ተጽእኖ ማሳደር በተለምዶ ጥቅም ላይ የሚውሉት የሊሲስ መፍትሄዎች የ RNase እንቅስቃሴን ሊገታ ይችላል.ስለዚህ, የሊሲስ መፍትሄን የመምረጥ ቁልፍ ነጥብ ከማጣራት ዘዴ ጋር በማጣመር ግምት ውስጥ ማስገባት ነው.አንድ የተለየ ነገር አለ፡-ከፍተኛ ኢንዛይም ያለው ኢንዛይም ይዘት ያላቸው ናሙናዎች ኢንዛይም ኢንዛይሞችን የማንቀሳቀስ ችሎታን ለመጨመር phenolን የያዘ ሊዛት እንዲጠቀሙ ይመከራል።

የመንጻት ዘዴ ምርጫ

የተረፈውን ውስጣዊ ቆሻሻዎች የሚነኩ ምክንያቶች፣ የማውጣት ፍጥነት ለንፁህ ናሙናዎች እንደ ህዋሶች ካሉ በማንኛውም የመንፃት ዘዴ አጥጋቢ ውጤት ማግኘት ይቻላል።ነገር ግን ለብዙ ሌሎች ናሙናዎች, በተለይም እንደ ተክሎች, ጉበት, ባክቴሪያ, ወዘተ የመሳሰሉ ከፍተኛ መጠን ያላቸው ቆሻሻዎች, ተስማሚ የመንጻት ዘዴን መምረጥ አስፈላጊ ነው.የአምድ ሴንትሪፉጋል የመንጻት ዘዴ ፈጣን የማውጣት ፍጥነት ያለው ሲሆን በቀጣይ የአር ኤን ኤ ኢንዛይም ምላሽ ላይ ተጽእኖ ያላቸውን ቆሻሻዎች ውጤታማ በሆነ መንገድ ያስወግዳል ነገር ግን ውድ ነው (ፎርጂን ወጪ ቆጣቢ ኪትስ ማቅረብ ይችላል፣ ተጨማሪ ዝርዝሮችን ጠቅ ያድርጉእዚህ);እንደ LiCl ዝናብ ያሉ ኢኮኖሚያዊ እና ክላሲክ የመንፃት ዘዴዎችን በመጠቀም አጥጋቢ ውጤቶችን ሊያገኙ ይችላሉ ፣ ግን የቀዶ ጥገናው ጊዜ ረጅም ነው።.

"ሦስት ተግሣጽ እና ስምንት ትኩረት" ለ RNA Extraction

ተግሣጽ 1፡የውጭ ኢንዛይሞችን መበከል ያቁሙ።

ማስታወሻ 1፡-ጭምብል እና ጓንቶች በጥብቅ ይልበሱ።

ማስታወሻ 2፡-በሙከራው ውስጥ የተካተቱት የሴንትሪፉጅ ቱቦዎች፣ የቲፕ ራሶች፣ የፓይፕት ዘንጎች፣ የኤሌክትሮፎረስ ታንኮች እና የሙከራ ወንበሮች በደንብ መወገድ አለባቸው።

ማስታወሻ 3፡-በሙከራው ውስጥ የተካተቱት ሪጀንቶች/መፍትሄዎች፣በተለይ ውሃ፣ከአርናሴ-ነጻ መሆን አለባቸው።

ተግሣጽ 2፡የውስጣዊ ኢንዛይሞችን እንቅስቃሴ አግድ

ማስታወሻ 4፡-ተገቢውን ግብረ-ሰዶማዊነት ዘዴ ይምረጡ.

ማስታወሻ 5፡-ተስማሚ lysate ይምረጡ.

ማስታወሻ 6፡-የናሙናውን መነሻ መጠን ይቆጣጠሩ.

ተግሣጽ 3፡የማውጣት አላማህን ግልጽ አድርግ

ማስታወሻ 7፡-ከፍተኛው የናሙና የመነሻ መጠን ሲቃረብ ማንኛውም የሊዛት ስርዓት፣ የማውጣት ስኬት መጠን በከፍተኛ ሁኔታ ይቀንሳል።

ማስታወሻ 8፡-ለስኬታማ አር ኤን ኤ ማውጣት ብቸኛው ኢኮኖሚያዊ መስፈርት በቀጣይ ሙከራዎች ስኬት እንጂ ምርት አይደለም።

ምርጥ 10 የ RNase ብክለት ምንጮች

1. ጣቶች የውጭ ኢንዛይሞች የመጀመሪያ ምንጭ ናቸው, ስለዚህ ጓንቶች በተደጋጋሚ ሊለበሱ እና መተካት አለባቸው.በተጨማሪም, ጭምብሎችም እንዲሁ መደረግ አለባቸው, ምክንያቱም መተንፈስም አስፈላጊ የኢንዛይም ምንጭ ነው.የእጅ ጓንት ጭምብል ማድረግ ተጨማሪ ጥቅም ሞካሪውን መጠበቅ ነው.

2. Pipette ምክሮች፣ ሴንትሪፉጅ ቱቦዎች፣ pipettes – RNase በማምከን ብቻ ሊነቃ አይችልም፣ ስለዚህ pipette tips እና centrifuge tubes በDEPC መታከም አለባቸው፣ ምንም እንኳን እንደ DEPC መታከም ምልክት ተደርጎባቸዋል።ልዩ ዓላማ ያለው ፒፕት መጠቀም ጥሩ ነው, ከመጠቀምዎ በፊት በ 75% የአልኮል ጥጥ ኳስ ይጥረጉ, በተለይም ዘንግ;በተጨማሪም, ጭንቅላትን ለማስወገድ አለመጠቀምዎን እርግጠኛ ይሁኑ.

3. ውሃው/ማቋቋሚያው ከአርናሴ ብክለት የጸዳ መሆን አለበት።

4. ቢያንስ የሙከራ ጠረጴዛው በ 75% የአልኮል ጥጥ ኳሶች ማጽዳት አለበት.

5.Endogenous RNase ሁሉም ቲሹዎች ውስጣዊ ኢንዛይሞችን ይዘዋል፣ስለዚህ ፈሳሽ ናይትሮጅን ያላቸውን ቲሹዎች በፍጥነት ማቀዝቀዝ መበስበስን ለመቀነስ ምርጡ መንገድ ነው።የፈሳሽ ናይትሮጅን ማከማቻ/መፍጨት ዘዴ በእርግጥ የማይመች ነው፣ ነገር ግን ከፍተኛ ደረጃ ያላቸው ኢንዛይሞች ላሏቸው ሕብረ ሕዋሳት ብቸኛው መንገድ ነው።

6. የአር ኤን ኤ ናሙናዎች አር ኤን ኤ ማውጣት ምርቶች የ RNase ብክለትን ሊይዙ ይችላሉ።

7. Plasmid Extraction Plasmid Extraction ብዙ ጊዜ አር ኤን ለማዋረድ Rnase ይጠቀማል እና ቀሪው Rnase በፕሮቲን ኬ ተፈጭቶ በ PCI መውጣት አለበት።

8. የአር ኤን ኤ ማከማቻ በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ቢከማችም፣ የ RNase መጠን የአር ኤን ኤ መበላሸት ያስከትላል።አር ኤን ኤ ለረጅም ጊዜ ለማቆየት በጣም ጥሩው መፍትሄ የጨው / አልኮል እገዳ ነው, ምክንያቱም አልኮል በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ሁሉንም ኢንዛይሞችን ይከላከላል.

9. cations (Ca, Mg) እነዚህን ionዎች ሲይዝ, በ 80C ለ 5 ደቂቃዎች ማሞቅ አር ኤን ኤ እንዲሰነጠቅ ያደርገዋል, ስለዚህ አር ኤን ኤ ማሞቅ ካስፈለገ, የመጠባበቂያው መፍትሄ የኬልቲንግ ኤጀንት (1mM Sodium Citrate, pH 6.4) መያዝ አለበት.

10. በሚቀጥሉት ሙከራዎች ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውሉ ኢንዛይሞች በ RNase ሊበከሉ ይችላሉ.

10 ለ RNA Extraction ጠቃሚ ምክሮች

1: የ RNase እንቅስቃሴን በፍጥነት ይከላከሉ.ናሙናዎች ከተሰበሰቡ በኋላ በፍጥነት ይቀዘቅዛሉ, እና RNase በሊሲስ ጊዜ ፈጣን ቀዶ ጥገና እንዳይሰራ ይደረጋል.

2: ከፍተኛ የሪቦዚም ይዘት ላለው ቲሹ ተገቢውን የማስወጫ ዘዴ ይምረጡ እና adipose tissue phenol የያዘውን ዘዴ መጠቀም የተሻለ ነው።

3፡ የትንበያ ጥራት ሰሜናዊ ይፈልጋል፣ የሲዲኤንኤ ቤተመፃህፍት ግንባታ ከፍተኛ ታማኝነትን ይፈልጋል፣ እና RT-PCR እና RPA (Ribonuclease protection assay) ከፍተኛ ታማኝነት አያስፈልጋቸውም።RT-PCR ከፍተኛ ንፅህናን ይፈልጋል (የኢንዛይም መከላከያ ቀሪዎች)።

4፡ የተሟላ ግብረ-ሰዶማዊነት ምርትን ለማሻሻል እና መበላሸትን ለመቀነስ ቁልፉ ነው።

5፡ የአር ኤን ኤ ኤሌክትሮፊዮረሲስን ማወቅ ትክክለኛነት ያረጋግጡ፣ 28S፡ 18S = 2፡ 1 ሙሉ ምልክት ነው፣ 1፡ 1 ለአብዛኛዎቹ ሙከራዎችም ተቀባይነት አለው።

6፡ ዲኤንኤን ለ RT-PCR ማስወገድ፣ ድርድር ትንተና ዲኤንኤን ለማስወገድ ‹Dnase I›ን መጠቀም ጥሩ ነው።

7: የውጭ ኢንዛይሞችን ብክለት ይቀንሱ - ኢንዛይሞች ከውጭ ሊገቡ አይችሉም.

8: ዝቅተኛ-ማጎሪያ ኒዩክሊክ አሲድ በማተኮር ጊዜ, አብሮ-ዝናብ reagent መጨመር አለበት.ነገር ግን ኢንዛይሞችን እና የዲ ኤን ኤ መበከልን የያዘውን የጋር-ተቀባይነት ለመከላከል.

9: አር ኤን ኤውን በደንብ ይሟሟት, አስፈላጊ ከሆነ, በ 65C ሙቀት ለ 5 ደቂቃዎች.

ተስማሚ የማከማቻ ዘዴ

በ -20C ለአጭር ጊዜ, እና -80C ላይ ለረጅም ጊዜ ሊከማች ይችላል.የአር ኤን ኤ ምርትን ለማሻሻል የመጀመሪያው እርምጃ የተለያዩ ናሙናዎች አር ኤን ኤ ይዘት በጣም እንደሚለያይ መገንዘብ ነው።ከፍተኛ የተትረፈረፈ (2-4ug/mg) እንደ ጉበት፣ ቆሽት፣ ልብ፣ መካከለኛ መጠን (0.05-2ug/mg) እንደ አንጎል፣ ሽል፣ ኩላሊት፣ ሳንባ፣ ታይምስ፣ ኦቫሪ፣ ዝቅተኛ መጠን (<0.05ug/mg) mg) እንደ ፊኛ፣ አጥንት፣ ስብ።

1: የላይዝ ሴሎች አርኤን እንዲለቁ - አር ኤን ኤ ካልተለቀቀ ምርቱ ይቀንሳል.የኤሌክትሪክ ግብረ ሰዶማዊነት ከሌሎች ግብረ ሰዶማዊነት ዘዴዎች በተሻለ ሁኔታ ይሰራል ነገር ግን ከሌሎች ዘዴዎች ጋር መቀላቀል ሊያስፈልግ ይችላል ለምሳሌ ፈሳሽ ናይትሮጅን መፍጨት፣ ኢንዛይማቲክ መፈጨት (ሊሶዚሜ/ ሊቲኬሴስ)

2: የማውጫ ዘዴን ማመቻቸት.በ phenol ላይ የተመሰረቱ ዘዴዎች ትልቁ ችግሮች ያልተሟሉ ስትራቲፊኬሽን እና ከፊል አር ኤን ኤ መጥፋት ናቸው (የላይኛው ክፍል ሙሉ በሙሉ ሊወገድ አይችልም)።ያልተሟላ ስታቲስቲክስ በከፍተኛ የኒውክሊክ አሲድ እና ፕሮቲን ይዘት ምክንያት ነው, ይህም ጥቅም ላይ የዋለውን የሊዛት መጠን በመጨመር ወይም የናሙናውን መጠን በመቀነስ ሊፈታ ይችላል.የክሎሮፎርም የማውጣት እርምጃ ወደ አዲፖዝ ቲሹ ተጨምሯል።የአር ኤን ኤ ብክነት በኋለኛው ፓምፕ ወይም የኦርጋኒክ ሽፋንን በማስወገድ ሴንትሪፍግሽን ሊቀንስ ይችላል።በአምድ ማእከላዊ-ተኮር ዘዴዎች ትልቁ ችግር ከመጠን በላይ ናሙና ነው.

ክላሲክ የማውጣት ምክሮች

1. የፔኖል ማጣሪያ: እኩል መጠን 1: 1 ፐኖል / ክሎሮፎርም ይጨምሩ እና ለ 1-2 ደቂቃዎች አጥብቀው ይቀላቀሉ.ለ 2 ደቂቃዎች በከፍተኛ ፍጥነት ሴንትሪፉጅ.የሱፐርኔሽን (80-90%) በጥንቃቄ ያስወግዱ.ወደ መካከለኛው ንብርብር በጭራሽ አይግቡ።እኩል መጠን ያለው የምላሽ መፍትሄ ወደ ፌኖል/ክሎሮፎርም መጨመር እና ከመጠን በላይ መጨመር ይቻላል.ምርቱን ለማሻሻል ሁለቱ ሱፐርኔቶች ለኑክሊክ አሲድ ዝናብ አንድ ላይ ሊዋሃዱ ይችላሉ.በሚቀላቀሉበት ጊዜ በጣም ገር አይሁኑ, እና ሁሉንም ከመጠን በላይ ለማስወገድ አይሞክሩ.

2. ከ 70-80% ኢታኖል መታጠብ፡- በሚታጠብበት ጊዜ ኑክሊክ አሲድ ቀሪው ጨው እንዲታጠብ መታገድ አለበት።በተመሳሳይ ጊዜ ኤታኖልን ካፈሰሱ በኋላ በከፍተኛ ፍጥነት ለጥቂት ሰከንዶች ያህል ሴንቲግሬድ ያድርጉ እና ቀሪውን ኤታኖል በ pipette ያስወግዱት።ለ 5-10 ደቂቃዎች በቤት ሙቀት ውስጥ ከቆመ በኋላ ይቀልጡት.

11. ልዩ ድርጅቶችን ማውጣት

1. ፋይብሮስ ቲሹ፡- እንደ ልብ/አጥንት ጡንቻ ካሉ ፋይብሮስ ቲሹዎች ለአር ኤን ኤ ለማውጣት ቁልፉ የሕብረ ሕዋሳትን ሙሉ በሙሉ ማበላሸት ነው።እነዚህ ቲሹዎች ዝቅተኛ የሕዋስ እፍጋት ስላላቸው በአንድ ክፍል ክብደት ያለው አር ኤን ኤ አነስተኛ ነው፣ እና በተቻለ መጠን የመነሻ መጠን መጠቀም ጥሩ ነው።በቀዝቃዛ ሁኔታዎች ውስጥ ቲሹን በደንብ መፍጨትዎን ያረጋግጡ።

2. ከፍተኛ ፕሮቲን/ስብ ይዘት ያላቸው ቲሹዎች፡- የአንጎል/የአትክልት ስብ ይዘት ከፍተኛ ነው።ከ PCI ማውጣቱ በኋላ, የሱፐርኔቱ ነጭ ፍሎኩለስ ይዟል.ከመጠን በላይ ያለው ንጥረ ነገር በክሎሮፎርም እንደገና ማውጣት አለበት.

3. ከፍተኛ የኒውክሊክ አሲድ / ribozyme ይዘት ያላቸው ቲሹዎች: ስፕሊን / ቲምስ ከፍተኛ ኑክሊክ አሲድ እና ራይቦዚም ይዘት አላቸው.ፈጣን ግብረ-ሰዶማዊነት ከተከተለ በኋላ በቀዝቃዛ ሁኔታዎች ውስጥ ቲሹ መፍጨት ራይቦዚሞችን ውጤታማ በሆነ መንገድ ማገድ ይችላል።ነገር ግን, lysate በጣም ዝልግልግ ከሆነ (ምክንያት ከፍተኛ ኑክሊክ አሲድ ይዘት), PCI ማውጣት ውጤታማ stratify አይችልም;ተጨማሪ lysate ማከል ይህንን ችግር ሊፈታ ይችላል.በርካታ PCI ኤክስትራክሽን ተጨማሪ ቀሪ ዲ ኤን ኤ ማስወገድ ይችላሉ.አልኮሆል ከጨመረ በኋላ ነጭ ዝናብ ወዲያውኑ ከተፈጠረ, ይህ የዲ ኤን ኤ መበከልን ያመለክታል.ከሟሟ በኋላ በአሲዳማ PCI እንደገና ማውጣት የዲኤንኤ ብክለትን ያስወግዳል።

4. የእፅዋት ቲሹ፡- የእፅዋት ቲሹ ከእንስሳት ቲሹ የበለጠ ውስብስብ ነው።በአጠቃላይ እፅዋቱ በፈሳሽ ናይትሮጅን መሰረት ይፈጫሉ፣ ስለዚህ አር ኤን ኤ በውስጣዊ ኢንዛይሞች መበላሸቱ ያልተለመደ ነው።የማሽቆልቆሉ ችግር ካልተቀረፈ, በእርግጠኝነት በናሙና ውስጥ በተካተቱ ቆሻሻዎች ይከሰታል.በብዙ እፅዋት ውስጥ የተካተቱት ቆሻሻዎች ወደ ቅሪቶች ይመራሉ ፣ እና የተረፈበት ምክንያት ብዙውን ጊዜ እነዚህ ቆሻሻዎች ከአር ኤን ኤ ጋር አንዳንድ ተመሳሳይነት ስላላቸው ነው፡ አንተ ትቀሰቅሰዋለህ እና እኔ እጨምራለሁ፣ እና አንተ ተስማምተኝ እና እኔ አዝናለሁ።እነዚህ ባህሪያት በጣም ኃይለኛ የኢንዛይም መከላከያዎች መሆናቸውን ይወስናሉ.

በአሁኑ ጊዜ, የንግድ አር ኤን ኤ ማውጣት reagents በትንሹ ማስተካከያ ጋር ሁሉም ማለት ይቻላል የእንስሳት ሕብረ ጋር ማስማማት ይቻላል, ነገር ግን ጥቂት የንግድ ኤን ኤክስትራክሽን reagents ለአብዛኞቹ የእጽዋት ቲሹዎች ተስማሚ ሊሆኑ ይችላሉ.እንደ እድል ሆኖ, Foregene ልዩ ሊያቀርብ ይችላልየዕፅዋት አር ኤን ኤ ማውጣት እቃዎች, እና አለነየእፅዋት ጠቅላላ አር ኤን ኤ ማግለል ስብስብ, የእፅዋት ጠቅላላ አር ኤን ኤ ማግለል ኪት ፕላስ.የኋለኛው በተለይ የተነደፈው ከፍተኛ የፖሊሲካካርዴ እና ፖሊፊኖል ይዘት ላላቸው ዕፅዋት ነው።ለአር ኤን ኤ ማውጣት፣ የላብራቶሪ ተጠቃሚዎች አስተያየት በተለይ ጥሩ ነው።

12. የናሙና ማቀዝቀዝ እና ማቅለጥ የሚያስከትለው ውጤት የቀዘቀዘው ናሙና ትልቅ ሊሆን ይችላል, እና ለአር ኤን ኤ ለማውጣት ጥቅም ላይ ከመዋሉ በፊት መቁረጥ ያስፈልጋል.ናሙናዎች በሚቆረጡበት ጊዜ ማቅለጥ (በከፊል ሊሆን ይችላል).የቀዘቀዙ ናሙናዎች አር ኤን ኤ ከመውጣቱ በፊት መመዘን ሊኖርባቸው ይችላል፣ እና በዚህ ሂደት ውስጥ ማቅለጥ በእርግጠኝነት ይከሰታል።አንዳንድ ጊዜ የናሙናው ማቅለጥ በፈሳሽ ናይትሮጅን መፍጨት ሂደት ውስጥ ይከሰታል;ወይም የቀዘቀዘው ናሙና ፈሳሽ ናይትሮጅን ሳይፈጭ በቀጥታ ወደ ሊዛት ይጨመራል, እና ማቅለጥ በእርግጠኝነት ሙሉ በሙሉ ተመሳሳይነት ከመፈጠሩ በፊት ይከሰታል.ሙከራዎች እንደሚያሳዩት የቀዘቀዙ ቲሹዎች በሚቀልጡበት ጊዜ ለአር ኤን ኤ መበላሸት የተጋለጠ ከትኩስ ቲሹ የበለጠ ነው።ሊሆን የሚችልበት ምክንያት፡- የቀዝቃዛ ሂደት በሴሉ ውስጥ ያሉ አወቃቀሮችን ስለሚረብሽ ውስጣዊ ኢንዛይሞች ከአር ኤን ኤ ጋር በቀጥታ እንዲገናኙ ያደርጋል።

13. ስለ አር ኤን ኤ ጥራት መወሰን አብዛኛውን ጊዜ ኤሌክትሮፊዮሬሲስ የአር ኤን ኤውን ትክክለኛነት ለመዳኘት ጥቅም ላይ ይውላል, እና A260/A280 የአር ኤን ኤ ንጽህናን ለመዳኘት ይጠቅማል.በንድፈ ሀሳብ፣ ያልተነካ አር ኤን ኤ 28S፡18S = 2.7፡1 ሬሾ አለው፣ እና አብዛኛው መረጃ የ28S፡18S = 2፡1 ጥምርታ ላይ ያተኩራል።እውነታው ግን ከሴሎች በስተቀር ከናሙናዎች የሚወጣ ማንኛውም አር ኤን ኤ በ2፡1 ጥምርታ ውስጥ የለም (ይህ የተገኘው በAgilent Bioanalyzer) ነው።

የአር ኤን ኤ የኤሌክትሮፊዮርስስ ውጤቶች በብዙ ነገሮች ተጎድተዋል፣የሁለተኛ ደረጃ መዋቅር፣የኤሌክትሮፊረስስ ሁኔታዎች፣የናሙና ጭነት፣የኢቢ ሙሌትነት ደረጃ፣ወዘተ።አር ኤን ኤ ለመለየት እና ዲኤንኤ ማርከርን እንደ መቆጣጠሪያ ይጠቀሙ።28S በ 2kb እና 18S በ 0.9kb እና 28S: 18S> 1 ግልጽ ከሆኑ ንፁህነቱ የብዙ ተከታይ ሙከራዎችን መስፈርቶች ሊያሟላ ይችላል።

A260/A280 ብዙ ግራ መጋባት የፈጠረ አመላካች ነው።በመጀመሪያ ደረጃ, ለኒውክሊክ አሲዶች የዚህን አመላካች የመጀመሪያ ትርጉም ግልጽ ማድረግ አስፈላጊ ነው ንጹህ አር ኤን ኤ, የእሱ A260/280 = 2.0 ገደማ.ንጹህ አር ኤን ኤ 'መንስኤ' ሲሆን A260/A280 = 2 'ውጤቱ' ነው።አሁን ሁሉም ሰው A260/A280ን እንደ 'ምክንያት' እየተጠቀመበት ነው, "A260/A280 = 2 ከሆነ, RNA ንፁህ ነው" ብሎ በማሰብ በተፈጥሮ ግራ መጋባትን ያመጣል.

ከፈለጋችሁ በኤር ኤን ኤ ናሙና ላይ እንደ ፌኖል፣ ጓኒዲን ኢሶቲዮሲያኔት፣ ፒኢጂ፣ ወዘተ የመሳሰሉትን በማውጣት ላይ በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለውን ትንሽ ሬጀንት ማከል እና ከዚያ የA260/A280 ሬሾን መለካት ይችላሉ።እውነታው ግን ለአር ኤን ኤ ለማውጣት የሚያገለግሉት አብዛኛዎቹ ሪጀንቶች፣ እንዲሁም በናሙናው ውስጥ ያሉ ብዙ ቆሻሻዎች A260 እና A280 አካባቢ ስለሚወስዱ A260/A280 ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል።

በአሁኑ ጊዜ በጣም አስተማሪው አቀራረብ የአር ኤን ኤ ናሙናዎችን በ200-300 nm ክልል ውስጥ መቃኘት ነው።የንፁህ አር ኤን ኤ ከርቭ የሚከተሉት ባህሪያት አሉት፡ ኩርባው ለስላሳ ነው፣ A230 እና A260 ሁለት የመቀየሪያ ነጥቦች ናቸው፣ A300 ወደ 0 ቅርብ ነው፣ A260/A280 = 2.0 አካባቢ፣ እና A260/A230 = 2.0 አካባቢ ነው።የፍተሻ ውሂብ የማይገኝ ከሆነ፣ ይህ ሬሾ የኢንዛይም ምላሽን የሚነኩ ሁሉንም ቆሻሻዎች ለመሸከም የበለጠ ተጋላጭ ስለሆነ የA260/A230 ጥምርታ እንዲሁ መወሰን አለበት።የመሳሪያውን የመስመር ክልል (0.1-0.5 ለ A260) ግምት ውስጥ ያስገቡ.

ሌሎች ሁለት ጠቃሚ ክስተቶች አሉ: A260 / A280 በውሃ ውስጥ በሚለካበት ጊዜ ሬሾው ወደ 0.3 ዝቅተኛ ይሆናል;በ10 mM EDTA ውስጥ የሚለካው ሬሾ በ1 ሚሜ EDTA ከሚለካው 0.2 ገደማ ከፍ ያለ ነው።

ተዛማጅ ምርቶች፡

የቻይና ተክል ጠቅላላ አር ኤን ኤ ማግለል ኪት አምራች እና አቅራቢ |Foregene (foreivd.com)

አር ኤን ኤ ማግለል ተከታታይ አቅራቢዎች እና ፋብሪካ |የቻይና አር ኤን ኤ ማግለል ተከታታይ አምራቾች (foreivd.com)

አር ኤን ኤ ማግለል ተከታታይ – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)