የመለየት ልዩነት

በአብዛኛዎቹ ሁኔታዎች, የፕሪመር ዲዛይን ዓላማ የ PCR ልዩነትን ከፍ ለማድረግ ነው.ይህ በብዙ ተለዋዋጮች ብዙ ወይም ባነሰ ሊተነበይ የሚችል ተጽእኖ ይወሰናል.አንድ አስፈላጊ ተለዋዋጭ በፕሪመር 3′ መጨረሻ ላይ ያለው ቅደም ተከተል ነው።

በአስፈላጊ ሁኔታ፣ ለልዩነት የተነደፉ የ PCR ሙከራዎች በሰፊው ተለዋዋጭ ክልል ውስጥ ከፍተኛ ቅልጥፍናን የመጠበቅ ዕድላቸው ከፍተኛ ነው፣ ምክንያቱም ምርመራው ልዩ ያልሆኑ የማጉላት ምርቶችን አያመጣም፣ በዚህም ከ PCR reagents ጋር በመወዳደር ወይም ዋናውን የማጉላት ምላሽን ይከለክላል።

እርግጥ ነው, በአንዳንድ ሁኔታዎች, ልዩነት በጣም አስፈላጊ አይደለም, ለምሳሌ, ግቡ በቅርበት የሚዛመዱትን ለመለካት ሲፈልጉ ነገር ግን የተለያዩ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን, ልዩ ንድፍ, ማመቻቸት እና የማረጋገጫ ደረጃዎች ያስፈልጋሉ.

የማቅለጫ ኩርባ የአምፕሊኮኖችን ልዩነት ለመገምገም ቢያንስ አንድን ኢላማ ለማጉላት የሚያስችል መደበኛ ዘዴ ነው።ነገር ግን፣ የማቅለጫ ኩርባዎች አሳሳች ሊሆኑ እንደሚችሉ አጽንኦት ሊሰጠው ይገባል ምክንያቱም ለምሳሌ፣ በንዑስ ምርጥ ፕሪመርሮች እና በዝቅተኛ የአብነት ውህዶች ጥምር ውጤቶች ሊነኩ ይችላሉ።

P5 |የማቅለጫው ኩርባ የTm ፈረቃዎችን በሁለት የተነጣጠሩ ዲ ኤን ኤዎች መጠን ከሁለት ግኝት የተገኙትን ያሳያል።

ሀ. ከፍ ባለ መጠን (ማስታወቂያ)) የqPCR መለኪያ ከተጠናቀቀ በኋላ ግልጽ የሆነ የፕሪመር ዲመር የለም።የአብነት ትኩረት ወደ 50 ቅጂዎች (ሠ) ሲቀንስ ልዩ ያልሆነ ምርት መታየት ይጀምራል እና በዝቅተኛው ትኩረት (ረ) ብቸኛው ምርት ይሆናል።

ለ. ፈተናው በሁሉም የዒላማ ማዕከሎች ላይ ተመሳሳይ ቲሞችን መዝግቧል፣ እና በትንሹ ትኩረት (5 ቅጂዎች) እንኳን ግልጽ የሆነ የፕሪመር ዲመር አልነበረም።እነዚህን ሁለት የመፈለጊያ ዘዴዎች ሲጠቀሙ፣ በNTCs ውስጥ ምንም የማጉላት ምርቶች አልተገኙም።

P5 አብነት በተለያየ መጠን የሚገኝበትን ናሙናዎች የተገኙትን የመፍታታት ኩርባዎችን ያሳያል።P 5a እንደሚያሳየው በሁለቱ ዝቅተኛ ውህዶች, ልዩ ያልሆኑ የማጉላት ምርቶች Tms ከተወሰኑ አምፖች ያነሰ ነው.

በግልጽ ለማየት እንደሚቻለው, ይህ የመፈለጊያ ዘዴ በአነስተኛ መጠን ውስጥ ያሉ ኢላማዎችን ለመለየት በአስተማማኝ ሁኔታ ጥቅም ላይ ሊውል አይችልም.

የሚገርመው፣ ኤንቲሲዎች፣ ማለትም፣ ምንም አይነት ዲኤንኤ የሌላቸው ናሙናዎች፣ (ያልሆኑ) የማጉላት ምርቶችን አልመዘገቡም፣ ይህም የጀርባ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ልዩ ባልሆነ ማጉላት/ፖሊሜራይዜሽን ውስጥ መሳተፍ እንደሚችል ያሳያል።

አንዳንድ ጊዜ እንደዚህ ያሉ የጀርባ ፕሪመርሮች እና ልዩ ያልሆኑ ማጉላት ሊታረሙ አይችሉም, ነገር ግን ብዙውን ጊዜ በማንኛውም የአብነት ማጎሪያ እና NTC (P 5b) ውስጥ ልዩ ያልሆነ ማጉላት የሌለውን የመለየት ዘዴን መንደፍ ይቻላል.

እዚህ፣ የታለመውን ትኩረት ማጉላት በCq 35 መመዝገብ እንኳን የተወሰነ የመሟሟት ከርቭ ይፈጥራል።በተመሳሳይ፣ ኤንቲሲዎች የተለየ ያልሆነ የማጉላት ምልክቶች አላሳዩም።አንዳንድ ጊዜ የመለየት ባህሪው በእናቲቱ መጠጥ ላይ የተመሰረተ ሊሆን ይችላል፣ እና ልዩ ያልሆነ ማጉላት ብቻ በተወሰኑ ቋት ቅንጅቶች ውስጥ ተገኝቷል፣ ይህም ከተለያዩ የMg2+ ውህዶች ጋር ሊዛመድ ይችላል።

የመለየት መረጋጋት

የTa ማመቻቸት በqPCR ፈልጎ ማግኘት ላይ በተጨባጭ የማረጋገጫ እና የማመቻቸት ሂደት ውስጥ ጠቃሚ እርምጃ ነው።NTCን ሳያሳድጉ ዝቅተኛውን Cq የሚያመነጨውን የሙቀት መጠን (ወይም የሙቀት መጠን) በማሳየት የፕሪመር ስብስብ ጥንካሬን በቀጥታ ያሳያል።

ከሁለት እስከ አራት እጥፍ ያለው የስሜታዊነት ልዩነት ከፍተኛ mRNA አገላለጽ ላላቸው ሰዎች አስፈላጊ ላይሆን ይችላል ነገር ግን ለምርመራ ሙከራዎች በአዎንታዊ እና በውሸት አሉታዊ ውጤቶች መካከል ያለውን ልዩነት ሊያመለክት ይችላል።

የqPCR primers የ Ta ባህሪያት በጣም ሊለያዩ ይችላሉ።አንዳንድ ፈተናዎች በጣም ጠንካራ አይደሉም, እና እነርሱ primers መካከል ለተመቻቸ Ta ዋጋ ስር አልተደረጉም ከሆነ, በፍጥነት ይወድቃሉ.

ይህ በጣም አስፈላጊ ነው ምክንያቱም የዚህ ዓይነቱ ማወቂያ በእውነተኛው ዓለም ውስጥ ብዙ ጊዜ ችግር ያለበት ነው, እና የናሙና ንፅህና, የዲኤንኤ ትኩረት ወይም የሌላ ዲ ኤን ኤ መገኘት ጥሩ ላይሆን ይችላል.

በተጨማሪም፣ የታለመው ቅጂ ቁጥሩ በሰፊ ክልል ሊለያይ ይችላል፣ እና ሬጀንቶች፣ የፕላስቲክ እቃዎች ወይም መሳሪያዎች ፈተናውን ሲያዘጋጁ ጥቅም ላይ ከሚውሉት ሊለዩ ይችላሉ።

P6|የሙቀት መጠኑ የ PCRን መለየት የተለያዩ ጥንካሬዎችን ያሳያል።

ሀ. ከሰው አንጎል አር ኤን ኤ በተዘጋጀው ሲዲኤን ላይ PCR ለመስራት የባዮሊን ሴንሲፋስት SYBR ማስተርሚክስ (ካታሎግ ቁጥር BIO-98050) ይጠቀሙ።

ለ. የአፓሌን የማጉላት ካርታ እና የመሟሟት ከርቭ (NM_033207፣ F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC፣ R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG) ለመቅዳት የባዮ-ራድ CFX qPCR መሳሪያ ይጠቀሙ።

ሐ. የ ACSBG1 የማጉላት ግራፍ እና መቅለጥ (NM_015162.4፣ F: CTACCTTCCGGCACCACTGG፣ R: GTCCACGTGATATTGCTTTGACTCAG)።

መ. የጂኤፍኤፒ የማጉላት ግራፍ እና መሟሟት (NM_002055.5፣ F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG፣ R: CGAACCTCCTCCTCGTGATCTTC)።

E.Cqs በተለያየ የማደንዘዣ የሙቀት መጠን የተመዘገቡ፣ በ 7C የሙቀት ቅልመት ስር የተመዘገበውን Cq ልዩነት ያሳያል።

P 6 የተለመደ የማይፈለግ ምርመራ ውጤት ያሳያል፣ይህም qPCR በ 59C እና 67C (P 6a) መካከል ባለው የግራዲየንት Tas በመጠቀም፣ ለሶስት ሰው አእምሮ-ተኮር ጂኖች ፕሪመር በመጠቀም የተሰራ ነው።

ከድምጽ ማጉያው ግራፍ ላይ ማየት የሚቻለው የኦፓሊን ፕሪመርዎች በጣም ጥሩ አይደሉም ምክንያቱም የእነሱ ምርጥ Ta ክልል በጣም ጠባብ ነው (ምስል 6 ለ) ፣ ማለትም ፣ Cqs በሰፊው የተበታተኑ ናቸው ፣ በዚህም ምክንያት Cqs ከምርጥ Cqs Low ጋር ሲነፃፀሩ ጉልህ ነው።

ይህ የማወቂያ ዘዴ ያልተረጋጋ ነው እና ወደ ንዑስ ማጉላት ሊያመራ ይችላል።ስለዚህ, ይህ ጥንድ ፕሪመር እንደገና ዲዛይን መደረግ አለበት.በተጨማሪም የማቅለጫ ኩርባ ትንተና (ኢንሴት) እንደሚያሳየው የዚህ የመፈለጊያ ዘዴ ልዩነትም ችግር ያለበት ሊሆን ይችላል, ምክንያቱም የእያንዳንዱ Ta መቅለጥ ኩርባ የተለየ ነው.

በፒ 6ሲ ላይ የሚታየው ACSBG1 የመፈለጊያ ዘዴ ከላይ ካለው የኦፓሊን መፈለጊያ ዘዴ የበለጠ ጠንካራ ነው፣ነገር ግን አሁንም ከትክክለኛው የራቀ ነው፣ እና ሊሻሻል የሚችልበት እድል ሰፊ ነው።

ሆኖም ግን, በጠንካራነት እና በንፅፅር መካከል ምንም አስፈላጊ ግንኙነት እንደሌለ አፅንዖት እንሰጣለን, ምክንያቱም በዚህ የመፈለጊያ ዘዴ የተፈጠረው የሟሟ ኩርባ በሁሉም Tas (ኢንሴት) ውስጥ ያለውን ከፍተኛ ዋጋ ያሳያል.

በሌላ በኩል፣ የጥንካሬ ፈተናው የበለጠ ታጋሽ ነው፣ ተመሳሳይ Cqs በብዙ በታስ ክልል ውስጥ በማምረት፣ በፒ 6d ላይ እንደሚታየው የጂኤፍኤፒ ሙከራ።

በተመሳሳዩ የ 8 ዲግሪ ሴልሺየስ ክልል ውስጥ የተገኘው የ Cqs ልዩነት ከ 1 ያነሰ ነው, እና የመፍታታት ኩርባ (ኢንሴት) በዚህ የሙቀት ክልል ውስጥ ያለውን የመለየት ባህሪያት ያረጋግጣል.የሚሰላው Tas እና ትክክለኛው የ Ta ክልል በጣም የተለየ ሊሆን እንደሚችል ልብ ሊባል የሚገባው ጉዳይ ነው።

ተመራማሪዎች ቀልጣፋ ፕሪመርቶችን ለመንደፍ እንዲረዳቸው የተነደፉ ብዙ መመሪያዎች አሉ፣ አብዛኛዎቹ በረጅም ጊዜ የተመሰረቱ ህጎች ላይ የተመሰረቱ እና ለ 3'end of the primers ብዙ ትኩረት ተሰጥቷል።ብዙውን ጊዜ G ወይም C በ 3' መጨረሻ እና ሁለት G ወይም C መሠረቶች (ጂሲ ክላምፕ) እንዲያካትቱ ይመከራል ነገር ግን ከመጨረሻዎቹ 5 መሠረቶች ከሁለት አይበልጡም።

በተግባር እነዚህ ደንቦች ተመራማሪዎችን ሊመሩ ይችላሉ, ነገር ግን በሁሉም ሁኔታዎች ውስጥ የግድ ትክክል አይደሉም.

P7 |የፕሪመር 3'ፍጻሜ በልዩነት ወይም በቅልጥፍና ላይ ትንሽ ተጽእኖ የለውም።

ሀ. ለሰብአዊው HIF-1a (NM_181054.2) ጂን የመነሻዎች አቀማመጥ.

ለ. ስድስት የሙከራ እቃዎችን ለማጉላት Agilent Brilliant III SYBR አረንጓዴ እናት መጠጥ (ድመት ቁጥር 600882) ይጠቀሙ።

ሐ. በባዮ-ራድ CFX qPCR መሣሪያ እና 3'end primers የተመዘገበ የማጉላት ግራፍ እና መቅለጥ።ኤንቲሲዎች በቀይ ይታያሉ።

D. Cqs የእያንዳንዱ የሙከራ ንጥል መዝገብ

ለምሳሌ, በ P 7 ውስጥ ያለው ውጤት ከ 3 ኛው ደንብ ጋር ይቃረናል.ሁሉም ዲዛይኖች በመሠረቱ ተመሳሳይ ውጤት ያስገኛሉ፣ በNTC ውስጥ ልዩ ያልሆኑ ማጉላት የሚመሩ ሁለት የፕሪመር ውህዶች ብቻ ናቸው።

ሆኖም ግን የጂሲ ክሊፕን ተፅእኖ መደገፍ አንችልም ምክንያቱም በዚህ ሁኔታ A ወይም T ቢበዛ 30 መሠረቶችን መጠቀም ልዩነቱን አይቀንስም.

የሙከራ C፣ F primer በGGCC የሚያልቅበት፣ Cqs በNTC ውስጥ መዝግቧል፣ ይህም አንድ ሰው እነዚህን ቅደም ተከተሎች በ30-መጨረሻ ላይ ማስወገድ እንደሚፈልግ ያሳያል።የፕሪመር ጥንድ ምርጡን 3′end ቅደም ተከተል ለመወሰን ብቸኛው መንገድ የተወሰኑ እጩዎችን በሙከራ መገምገም እንደሆነ አበክረን እንገልፃለን።

የማጉላት ብቃት

በአስፈላጊ ሁኔታ፣ ምንም እንኳን ልዩ ያልሆነ PCR መለየት በፍፁም የተለየ ሊሆን ባይችልም፣ የማጉላት ብቃቱን ማስተካከል እና በተለያየ መንገድ ኢንዛይሙን፣ የእናትን መጠጥ፣ ተጨማሪዎችን እና የብስክሌት ሁኔታዎችን በመቀየር ማሳደግ ይቻላል።

የ PCR ማወቂያን ውጤታማነት ለመገምገም ከተፈለገው ኒዩክሊክ አሲድ 10 ወይም 5 እጥፍ የሆነ ተከታታይ ማቅለጫ መጠቀም ጥሩ ነው, ማለትም "መደበኛ ከርቭ ዘዴ".

PCR amplicons ወይም ሠራሽ የዲኤንኤ ኢላማዎች መደበኛ ኩርባ ለማመንጨት ጥቅም ላይ ከዋሉ፣ የእነዚህ ኢላማዎች ተከታታይ ዳይሉሽን ከቋሚ ዲ ኤን ኤ (እንደ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ) ጋር መቀላቀል አለበት።

P8 |የ PCR ቅልጥፍናን ለመገምገም Dilution ከርቭ.

ሀ. ለፒሲአር እና ለመቅለጥ ከርቭ ሁኔታዎች ለHIF-1፡ F፡ AAGAACTTTTAGGCCGCTCA እና R፡TGTCCTGTGGTGACTTGTCC እና Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (ካታሎግ ቁጥር 600882) primers ይጠቀሙ።

ለ.የማቅለጫው ኩርባ በመግቢያው ላይ ይታያል.

C. ለሁለተኛው የሲዲኤንኤ ናሙና የ RT ምላሽ፣ ማቅለጫ እና ተከታታይ ዳይሉሽን ተደግሟል፣ ውጤቶቹም ተመሳሳይ ናቸው።

P 8 በሁለት የተለያዩ የሲዲኤንኤ ናሙናዎች ላይ ተመሳሳይ የመፈለጊያ ዘዴን በመጠቀም ሁለት መደበኛ ኩርባዎችን ያሳያል, ውጤቱም አንድ አይነት ቅልጥፍና ነው, ወደ 100% ገደማ, እና የ R2 እሴቱ እንዲሁ ተመሳሳይ ነው, ማለትም, በሙከራው መረጃ እና በመመለሻ መስመር ወይም በመረጃ መስመር መካከል ያለው የመገጣጠም ደረጃ.

ሁለቱ መደበኛ ኩርባዎች ተመጣጣኝ ናቸው, ግን በትክክል አንድ አይነት አይደሉም.ዓላማው ዒላማውን በትክክል ለመለካት ከሆነ, እርግጠኛ አለመሆንን ሳይገልጹ የቅጂ ቁጥር ስሌት መስጠት ተቀባይነት እንደሌለው ልብ ሊባል ይገባል.

P9 |መደበኛ ኩርባን በመጠቀም ከቁጥር ጋር የተያያዘ የመለኪያ እርግጠኛ አለመሆን.

ሀ. PCR እና የማቅለጫ ኩርባ ሁኔታዎችን ለማከናወን ለGAPDH (NM_002046) ፕሪመር ይጠቀሙ።ረ፡ ACAGTTGCCATGTAGACC እና አር፡ TAACTGGTTGAGCACAGG እና የባዮሊን ሴንሲፋስት SYBR ማስተርሚክስ (የካታሎግ ቁጥር BIO-98050)።

B. የማጉላት ገበታ፣ መቅለጥ ከርቭ እና መደበኛ ከርቭ በባዮ-ራድ CFX qPCR መሳሪያ ተመዝግቧል።

ሐ. መደበኛ ከርቭ ግራፍ እና 95% የመተማመን ክፍተት (CI)።

መ. ከዲሉሽን ኩርባ የተገኙት የሶስቱ Cq እሴቶች ቅጂ ቁጥር እና 95% የመተማመን ልዩነት።

P 9 የሚያሳየው ለተመቻቸ ፈተና፣ የአንድ መደበኛ ኩርባ ተፈጥሯዊ ተለዋዋጭነት በግምት 2 ጊዜ (95% የመተማመን ልዩነት፣ ከዝቅተኛ እስከ ከፍተኛ) ሲሆን ይህም የሚጠበቀው ትንሹ ተለዋዋጭነት ሊሆን ይችላል።

ተዛማጅ ምርት፡

የሕዋስ ቀጥታ RT qPCR ኪት

የመዳፊት ጭራ ቀጥተኛ PCR ኪት

የእንስሳት ቲሹ ቀጥታ PCR ኪት