የ RT-qPCR ሙከራ የአር ኤን ኤ ማውጣት እና የጥራት ግምገማ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ እና qPCR ሶስት ደረጃዎችን ያካትታል፣ እያንዳንዱ እርምጃ ብዙ ቅድመ ጥንቃቄዎች አሉት፣ ከዚህ በታች በዝርዝር እናስተዋውቃለን።

Ⅰአር ኤን ኤ ጥራት ግምገማ

በ RT-qPCR ሙከራ ውስጥ, አር ኤን ኤ ማውጣት ከተጠናቀቀ በኋላ, የአር ኤን ኤ ጥራት መገምገም ያስፈልገዋል, እና የክትትል ሙከራው ሊደረግ የሚችለው ብቃት ካለው በኋላ ብቻ ነው.የግምገማ ዘዴዎች ስፔክትሮፎቶሜትር ፣ አጊለንት ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ፣ አጊለንት 2100 ትንተና ፣ ከእነዚህም መካከል በብዛት ጥቅም ላይ የሚውሉት ስፔክሮፎቶሜትር እና አጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ዘዴን ያካትታሉ።የአር ኤን ኤ ጥራትን ለማረጋገጥ የአር ኤን ኤ ትኩረትን ፣ ንፅህናን እና ታማኝነትን ለመለየት እና ለመመርመር እነዚህን ሁለት ዘዴዎች አንድ ላይ መጠቀም እንደሚያስፈልግ ልብ ሊባል ይገባል።

ተዛማጅ አር ኤን ኤ ማግለል ስብስብ፡ 

የሕዋስ ጠቅላላ አር ኤን ኤ ማግለል ስብስብ

በጣም የተጣራ እና ከፍተኛ ጥራት ያለው አጠቃላይ አር ኤን ኤ ከተለያዩ የሰለጠኑ ሴሎች በ11 ደቂቃ ውስጥ ሊገኝ ይችላል።

የእንስሳት ጠቅላላ አር ኤን ኤ ማግለል ስብስብ

በፍጥነት እና በብቃት ከፍተኛ-ንፅህናን እና ከፍተኛ ጥራት ያላቸውን አጠቃላይ አር ኤን ኤ ከተለያዩ የእንስሳት ህዋሶች ማውጣት።

ስፔክትሮፕቶሜትር;

የስፔክትሮፎቶሜትር መለኪያው በዋናነት የአር ኤን ኤውን ትኩረት እና ንፅህና ለመወሰን ጥቅም ላይ ይውላል፣ነገር ግን የአር ኤን ኤ እና የጂኖሚክ ቅሪትን ትክክለኛነት መለየት አይችልም።ከነሱ መካከል A260/280 እና A260/230 ለአር ኤን ኤ ንፅህና ማወቂያ አስፈላጊ መለኪያዎች ሲሆኑ የአር ኤን ኤ ንፅህና በእሴቶቻቸው መለዋወጥ መሰረት ሊታወቅ ይችላል።

1. 1.9< A260/280< 2.1, አር ኤን ኤ ንፅህና ጥሩ መሆኑን ያመለክታል;A260/280 <1.9, በ RNA ውስጥ የፕሮቲን ቅሪት ሊኖር እንደሚችል ያሳያል;A260/280>2.1፣ ይህም የአር ኤን ኤ ከፊል መበስበስን የሚያመለክት ሲሆን ይህም በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮሬሲስ ሊረጋገጥ ይችላል።

2. 2.0

Agarose gel electrophoresis;

Agarose gel electrophoresis assay የአር ኤን ኤ ታማኝነትን፣ ጂኖም እና ፕሮቲን ቅሪቶችን ሊመረምር ይችላል፣ ነገር ግን የአር ኤን ኤውን መጠን በትክክል መለካት ወይም የኦርጋኒክ ሬጀንቶችን ቅሪቶች መለየት አይችልም።ለምሳሌ የ eukaryotic RNA አብነቶችን እንውሰድ፡-

1. አር ኤን ኤ በአጋሮሴስ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ተገድሏል.በጄል ካርታው ላይ ሶስት ነጠላ ባንዶች 28sRNA፣ 18sRNA እና 5.8sRNA ከነበሩ፣ የወጣው አር ኤን ኤ እንዳልነበረ ያሳያል።የመጎተት ክስተት ካለ, የአር ኤን ኤ በከፊል መበላሸትን ያመለክታል.

2. በሙጫ ቀዳዳ እና በ28sRNA ባንድ መካከል አንድ ብሩህ ባንድ ካለ የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ቅሪት ሊኖር ይችላል።

3. በማጣበቂያው ቀዳዳ ውስጥ ባንዶች ከታዩ, የፕሮቲን እና ሌሎች ማክሮ ሞለኪውላር ንጥረ ነገሮች ቅሪቶች ሊኖሩ እንደሚችሉ ያመለክታል.

Ⅱ. የተገላቢጦሽ ግልባጭ

አር ኤን ኤ ማውጣት ከተጠናቀቀ በኋላ ለቀጣይ ሙከራዎች ወደ ሲዲኤንኤ መቀየር ያስፈልገዋል, ስለዚህ የተገላቢጦሽ እርምጃ አስፈላጊ ነው.የተገላቢጦሽ ግልባጭ ከግልጽ ቅጂ እና ፕሪመር ምርጫ ይተዋወቃል፡-

የገለባ ምርጫ፡-

የተለመደው የተገላቢጦሽ ግልባጮች AMV RTase እና MMLV RTase ያካትታሉ።የ AMV RTase RNase H ጠንካራ እንቅስቃሴ አለው፣ የአጭር ውህደት ርዝመት፣ ዝቅተኛ ውህደት መጠን እና ጥሩ የሙቀት መረጋጋት (42 ~ 55 ℃)።የ MMLV RTase የ RNase H እንቅስቃሴ ደካማ ነው, የውህደቱ ርዝመት ረጅም ነው, የመዋሃዱ መጠን ከፍተኛ ነው, እና የሙቀት መረጋጋት ደካማ ነው (37 ~ 42 ℃).

RNase H ኢንዛይም አር ኤን ኤ አብነትን የማዋረድ ተግባር ስላለው፣ ኤምኤምኤልቪ ደካማ የ RNase H እንቅስቃሴ በግል በሚገለበጥበት ወቅት ይመረጣል፣ እና በኋላ የጄኔቲክ ምህንድስና በኋላ፣ የኤምኤምኤልቪ የሙቀት መረጋጋት ከፍተኛ ደረጃ ላይ ደርሷል።Foregene መውሰድአስቀድሞ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴ (ኤም-ኤም.ኤል.ቪ ለተገላቢጦሽ ግልባጭ) እንደ ምሳሌ፣ በጄኔቲክ ዳግም ማጣመር ቴክኖሎጂን በመጠቀም በኢ.ኮሊ ኢንጂነሪድ ባክቴሪያ ውስጥ የተገለጸ አዲስ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ነው።ተጨማሪ የዲ ኤን ኤ ፈትል ከአንድ-ክር ካለው አር ኤን ኤ፣ ዲ ኤን ኤ ወይም አር ኤን ኤ: ዲ ኤን ኤ ዲቃላ የሚያዋህድ ድጋሚ የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ ነው።ምንም የ RNase H እንቅስቃሴ፣ ጠንካራ መረጋጋት፣ ጠንካራ የአር ኤን ኤ ቅርበት እና ከፍተኛ የመለየት ስሜት የለውም።

 

አስቀድሞ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴ (ኤም-ኤም.ኤል.ቪ ለተገላቢጦሽ ግልባጭ)

የፕሪመር ምርጫ;

በአጠቃላይ RT primers በሶስት ምድቦች ይከፈላል፡ oligo dT፣ random primers እና gene-specific primers።በተለያዩ የሙከራ መስፈርቶች መሰረት ጥቅም ላይ የሚውሉ ተስማሚ ፕሪመርቶችን ይምረጡ.

1. አብነት eukaryotic ምንጭ ከሆነ እና ዘግይቶ cDNA ለወትሮው PCR ማጉያ ጥቅም ላይ የሚውል ከሆነ, Oligo (dT) ይመከራል;የሚቀጥለው ሙከራ ለqPCR ብቻ ጥቅም ላይ ከዋለ፣ ኦሊጎ (ዲቲ) የተገላቢጦሽ ግልባጭን ውጤታማነት ለማሻሻል በዘፈቀደ ፕሪመርሮች እንዲቀላቀል ይመከራል።

2. አብነቱ ከፕሮካርዮትስ ከሆነ፣ ራንደም ፕራይመሮች ወይም ጂን ልዩ ፕሪመር ለግልባጭ መመረጥ አለበት።

Ⅲ.qPCR

Fluorescence quantification በዋነኛነት የተብራራው ከቁጥር ዘዴዎች ምርጫ፣ የፕሪመር ንድፍ መርሆዎች፣ የ ROX ምርጫ፣ የምላሽ ስርዓት ውቅር እና የምላሽ ሁኔታዎች መቼት ወዘተ.

የመጠን ዘዴዎች ምርጫ;

የቁጥር ዘዴዎች ወደ አንጻራዊ የቁጥር ዘዴዎች እና ፍጹም የቁጥር ዘዴዎች የተከፋፈሉ ናቸው.አንዳንድ የሕክምና ዘዴዎች በጂን አገላለጽ ላይ ያለውን ተጽእኖ ለመለየት አንጻራዊ መጠንን መጠቀም፣ በተለያዩ ጊዜያት የጂን አገላለጽ ልዩነትን መለየት እና በተለያዩ ቲሹዎች ውስጥ ያለውን የጂን አገላለጽ ልዩነት ማወዳደር ይቻላል።ፍፁም መመዘኛ በቫይረሱ ​​ውስጥ ያለውን የኑክሊክ አሲድ መጠን እና የመሳሰሉትን መለየት ይችላል።ሙከራዎችን በምናደርግበት ጊዜ በራሳችን ሙከራዎች መሰረት ተገቢውን የመጠን ዘዴዎችን መምረጥ አለብን።

የመጀመሪያ ንድፍ መርሆዎች:

ለqPCR የፕሪመር ንድፍ በቀጥታ ከማጉላት ቅልጥፍና እና የምርት ልዩነት ጋር የተያያዘ ነው።ስለዚህ ጥሩ ፕሪመርቶችን በትክክል መንደፍ የተሳካ የqPCR የመጀመሪያ እርምጃ ነው።በፕሪመር ንድፍ ውስጥ የመደበኛውን የፕሪመር ንድፍ መርህ ሲያሟሉ የሚከተሉት መርሆዎች ትኩረት ሊሰጣቸው ይገባል.

1. የታለመው ቁራጭ ርዝመት በ 100 እና 300 bp መካከል ቁጥጥር ይደረግበታል;

2. የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ተጽእኖን ለማስወገድ ክሮስ-ኤክሰን ንድፍ;

3. የተነደፉትን ፕሪመርዎች ለማጉላት ውጤታማነት መሞከር አለባቸው, እና የማጉላት ብቃቱ ደረጃውን የጠበቀ (90-110%) ሲደርስ ብቻ ለቁጥር ሙከራዎች ሊጠቀሙበት ይችላሉ;

4. የፕሪመር ማጎሪያ አብዛኛውን ጊዜ በ0.1uM እና 1.0uM መካከል ይሻሻላል።

ምርጫሮክስ፡

በቁጥር ምላሽ ሂደት ውስጥ ROX የኦፕቲካል ዱካ ልዩነትን፣ የፓይፕቲንግ ስህተትን ወይም በአንድ ወጥ በሆነ በትነት እና በመተንፈሻ ምክንያት የተፈጠረውን የድምፅ ልዩነት በማስተካከል የውጤቱን ተደጋጋሚነት ማሻሻል ይችላል።ሆኖም ግን, የ ROX ምርጫ ከመሳሪያው ጋር የተያያዘ መሆኑን ልብ ሊባል ይገባል.የ qPCR መሳሪያው በቀዳዳዎች መካከል ያለውን ልዩነት በራስ ሰር የማረም ተግባር ካለው, ROX ን መጨመር አያስፈልገውም;አለበለዚያ የ ROX እርማት መጨመር ያስፈልገዋል.ሪኤጀንቶችን በመግዛት ረገድ ትናንሽ አጋሮች ትክክለኛውን ROX ለመምረጥ በሚጠቀሙበት መሣሪያ መሠረት መሆን አለባቸው ፣ በኋላ ላይ ስህተቶችን ያስወግዱ።

የምላሽ ስርዓት ዝግጅት;

የ 20ul እና 50ul ምላሽ መጠን ይመረጣል.ስርዓቱ ሲቀረጽ ለሚከተሉት ጉዳዮች ትኩረት መስጠት አለበት.

1. የምላሽ ስርዓቱ በአየር ማናፈሻ መዘጋጀት ያለበት እጅግ በጣም ንጹህ በሆነው የስራ ቤንች ፣ አዲስ ዲኤችኤች ውስጥ ነው።₂O ለእያንዳንዱ ሙከራ ጥቅም ላይ ይውላል;

2. እያንዳንዱ ሙከራ በስርዓቱ ውስጥ ብክለት መኖሩን ለማረጋገጥ NTCን ማዘጋጀት ያስፈልገዋል, እና እያንዳንዱ ጥንድ ፕሪመር ስርዓቱን ሲያዘጋጅ NTC ማድረግ አለበት;

3. በአር ኤን ኤ አብነት ውስጥ የ gDNA ቅሪት መኖሩን ለማወቅ NRT ለእያንዳንዱ ናሙና ሊዘጋጅ ይችላል;

4. ስርዓቱን በሚያዘጋጁበት ጊዜ ለአንድ ናሙና ቢያንስ 3 ቴክኒካል ድግግሞሾችን ማድረግ ይመከራል;

5. አብነት ሲዲኤንኤ ሲሆን የተገላቢጦሽ ግልባጭ ስርዓት በqPCR ሙከራ ላይ የሚያስከትለውን መከልከል ለመቀነስ 5-10 ጊዜ እንዲቀልጥ ይመከራል።የሲቲ እሴቱ በ20-30 መካከል እንዲወድቅ የአብነት መጠኑን በግራዲየንት ማሰስ የተሻለ ነው።

6. የሚፈለጉትን የምላሾች ብዛት ይወስኑ, በምላሾች ብዛት ላይ በ 5-10% ይጨምሩ እና የድምጽ ውቅር ቁጥርን ያሰሉ;

7, ስርዓቱ premix መርህ በመጠቀም የተዘጋጀ ነው, centrifugation በኋላ በማደባለቅ እና ምንም አረፋ ማረጋገጥ;

8, በተቻለ መጠን ደጋፊ የሆኑ የፍጆታ ዕቃዎችን ለመምረጥ.

ተዛማጅ RT-qPCR ኪት