Fluorescence quantitative PCR (እንዲሁም TaqMan PCR በመባልም ይታወቃል፣ ከዚህ በኋላ FQ-PCR) በ PE (Perkin Elmer) በዩናይትድ ስቴትስ በ1995 የተሰራ አዲስ ኒውክሊክ አሲድ መጠናዊ ቴክኖሎጂ ነው።ከተለዋዋጭ PCR ጋር ሲነጻጸር፣ FQ-PCR የቁጥራዊ ተግባሩን እውን ለማድረግ ብዙ ጥቅሞች አሉት።ይህ ጽሑፍ የቴክኖሎጂውን ባህሪያት, መርሆዎች, ዘዴዎች እና አተገባበር በአጭሩ ለመግለጽ ይፈልጋል.

1 ባህሪያት

FQ-PCR ተራ PCR ያለውን ከፍተኛ ትብነት ያለው ብቻ አይደለም: ነገር ግን ደግሞ ፍሎረሰንት መመርመሪያዎች መካከል ማመልከቻ በቀጥታ PCR ማጉላት ወቅት ፍሎረሰንት ሲግናል ለውጥ መለየት ይችላሉ photoelectric conduction ሥርዓት በኩል መደበኛ PCR ብዙ ድክመቶች ማሸነፍ ይህም የመጠን ውጤቶችን ለማግኘት, ስለዚህ ደግሞ ከፍተኛ የዲ ኤን ኤ hybridization እና spectroscopy ቴክኖሎጂ ከፍተኛ specificity አለው.

ለምሳሌ አጠቃላይ የ PCR ምርቶችን በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ እና ኤቲዲየም ብሮሚድ በአልትራቫዮሌት ብርሃን ወይም በ polyacrylamide gel electrophoresis እና በብር ቀለም መቀባት መታየት አለባቸው።ይህ ብዙ መሳሪያዎችን ብቻ ሳይሆን ጊዜ እና ጥረት ይጠይቃል.ኢቲዲየም ብሮማይድ ጥቅም ላይ የሚውሉት ነጠብጣቦች ለሰው አካል ጎጂ ናቸው, እና እነዚህ ውስብስብ የሙከራ ሂደቶች ለብክለት እና የውሸት አወንታዊ እድሎች ይሰጣሉ.ይሁን እንጂ FQ-PCR ናሙና በሚጫንበት ጊዜ ክዳኑን አንድ ጊዜ ብቻ መክፈት ያስፈልገዋል, እና የሚቀጥለው ሂደት ሙሉ በሙሉ የተዘጋ ቱቦ ነው, ይህም PCR ድህረ-ሂደትን አያስፈልገውም, በተለመደው PCR ስራዎች ውስጥ ብዙ ድክመቶችን ያስወግዳል.ሙከራው በአጠቃላይ በPE ኩባንያ የተሰራውን ABI7100 PCR thermal ሳይክል ይጠቀማል።

መሳሪያው የሚከተሉት ባህሪያት አሉት፡- ① ሰፊ አፕሊኬሽን፡ ለዲኤንኤ እና አር ኤን ኤ ፒሲአር ምርት መጠን፣ የጂን ኤክስፕረሽን ጥናት፣ በሽታ አምጪ ተህዋስያንን መለየት እና የ PCR ሁኔታዎችን ማመቻቸት ሊያገለግል ይችላል።② ልዩ የቁጥር መርህ፡- በፍሎረሰንት የተለጠፉ መመርመሪያዎችን በመጠቀም፣ የፍሎረሰንት መጠኑ ከጨረር ማነቃቂያ በኋላ ከ PCR ዑደት ጋር ይከማቻል፣ ስለዚህም የመጠን አላማን ለማሳካት።③ ከፍተኛ የስራ ቅልጥፍና፡ አብሮ የተሰራ 9600 PCR thermal cycler፣ በኮምፒዩተር ከ1 እስከ 2 ሰአታት የሚቆጣጠር የ96 ናሙናዎችን ማጉላት እና መጠናቸው በራስ-ሰር እና በተመሳሳይ ጊዜ።④ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ አያስፈልግም፡ ናሙናውን ማሟጠጥ እና ኤሌክትሮፊዮራይዝ ማድረግ አያስፈልግም፣ በምላሽ ቱቦ ውስጥ በቀጥታ ለመለየት ልዩ ምርመራ ብቻ ይጠቀሙ።⑤በቧንቧው ውስጥ ምንም አይነት ብክለት የለም፡ ልዩ የሆነው ሙሉ በሙሉ የተዘጋው የምላሽ ቱቦ እና የፎቶ ኤሌክትሪክ ማስተላለፊያ ስርዓት ተወስዷል፣ ስለዚህ ስለ ብክለት መጨነቅ አያስፈልግም።ውጤቶቹ ሊባዙ የሚችሉ ናቸው፡ የቁጥር ተለዋዋጭ ክልል እስከ አምስት የክብደት መጠኖች ነው።ስለዚህ, ይህ ቴክኖሎጂ በተሳካ ሁኔታ የተገነባ በመሆኑ, በብዙ የሳይንስ ተመራማሪዎች ዋጋ ያለው እና በብዙ መስኮች ተግባራዊ ሆኗል.

2 መርሆዎች እና ዘዴዎች

የFQ-PCR የስራ መርህ የታክ ኢንዛይም 5′→3′ exonuclease እንቅስቃሴን በመጠቀም የፍሎረሰንት ምልክት የተደረገበትን ፒሲአር ምላሽ ስርዓት ላይ መጨመር ነው።መርማሪው በተለይ በፕሪመር ቅደም ተከተል ውስጥ ካለው የዲኤንኤ አብነት ጋር ማዳቀል ይችላል።የፍተሻው 5'ጫፍ በFluorescence emission ጂን FAM (6-carboxyfluorescein፣ የፍሎረሰንስ ልቀት ከፍተኛ በ 518nm) እና 3'end በ The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine)፣ ፍሎረሰንስ 3 ፕሮብሌምቤርሆዳሚን፣ ፍሎረሰንስ 2 በ PCR ማጉላት ወቅት ምርመራው እንዳይራዘም ለመከላከል ፎስፈረስላይትድ።መርማሪው ሳይበላሽ ሲቀር፣ የኩንቸር ቡድን የሚለቀቀውን ቡድን የፍሎረሰንስ ልቀትን ያስወግዳል።አንድ ጊዜ የሚፈነጥቀው ቡድን ከማጥፋት ቡድን ከተለየ እገዳው ይነሳል እና በ 518nm ላይ ያለው የኦፕቲካል ጥግግት ይጨምራል እና በፍሎረሰንስ ማወቂያ ስርዓት ተገኝቷል።በተሃድሶው ምዕራፍ ላይ ምርመራው ከአብነት ዲ ኤን ኤ ጋር ይቀላቀላል እና በኤክስቴንሽኑ ውስጥ ያለው የታክ ኢንዛይም ከዲኤንኤው አብነት ጋር ይንቀሳቀሳል።መፈተሻው ሲቋረጥ, የማጥፊያው ውጤት ይለቀቃል እና የፍሎረሰንት ምልክት ይለቀቃል.አብነቱ በተገለበጠ ቁጥር አንድ ፍተሻ ይቋረጣል፣ የፍሎረሰንት ምልክት መለቀቅ ታጅቦ።በተለቀቁት ፍሎሮፎሮች ብዛት እና በ PCR ምርቶች ብዛት መካከል የአንድ ለአንድ ግንኙነት ስላለ ይህ ዘዴ አብነቱን በትክክል ለመለካት ሊያገለግል ይችላል።የሙከራ መሳሪያው በአጠቃላይ በ PE ኩባንያ የተሰራውን ABI7100 PCR thermal cycler ይጠቀማል እና ሌሎች የሙቀት ሳይክሎችም መጠቀም ይችላሉ።የ ABI7700 ምላሽ አይነት ምላሽ ስርዓት ለሙከራ ጥቅም ላይ ከዋለ, ምላሹ ከተጠናቀቀ በኋላ, የመጠን ውጤቶቹ በቀጥታ በኮምፒዩተር ትንተና ሊሰጡ ይችላሉ.ሌሎች የሙቀት ዑደቶችን የሚጠቀሙ ከሆነ፣ RQ+፣ RQ-፣ △RQን ለማስላት በምላሽ ቱቦ ውስጥ ያለውን የፍሎረሰንስ ምልክት በተመሳሳይ ጊዜ ለመለካት የፍሎረሰንስ ጠቋሚን መጠቀም ያስፈልግዎታል።RQ+ የናሙና ቱቦው የፍሎረሰንት ልቀት ቡድን የብርሃን መጠን ጥምርታን ይወክላል ወደ quenching ቡድን luminescence ጥንካሬ፣ RQ- በባዶ ቱቦ ውስጥ ያሉትን የሁለቱን ጥምርታ ይወክላል፣ △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) የፍሎረሰንት ልቀትን መጠን ይወክላል።የፍሎረሰንት መመርመሪያዎችን በማስተዋወቅ ምክንያት, የሙከራው ልዩነት በከፍተኛ ሁኔታ ተሻሽሏል.የፍተሻ ዲዛይኑ በአጠቃላይ የሚከተሉትን ሁኔታዎች ማሟላት አለበት፡- ① የፍተሻው ርዝመት ከ20-40 መሰረቶች መሆን አለበት የማሰሪያውን ልዩነት ለማረጋገጥ።②የነጠላ ኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተሎችን ማባዛትን ለማስቀረት የጂሲ ቤዝ ይዘት ከ40% እስከ 60% ነው።③ ማዳቀልን ያስወግዱ ወይም ከፕሪመር ጋር መደራረብ።④ በምርመራው እና በአብነት መካከል ያለው ትስስር መረጋጋት በፕሪመር እና በአብነት መካከል ካለው ትስስር መረጋጋት ይበልጣል፣ስለዚህ የፍተሻው Tm ዋጋ ከፕሪመር Tm ዋጋ ቢያንስ 5°C ከፍ ያለ መሆን አለበት።በተጨማሪም የመመርመሪያው ትኩረት, በምርመራው እና በአብነት ቅደም ተከተል መካከል ያለው ግብረ-ሰዶማዊነት እና በምርመራው እና በፕሪመር መካከል ያለው ርቀት ሁሉም በሙከራ ውጤቶች ላይ ተጽዕኖ ያሳድራሉ.

ተዛማጅ ምርቶች፡

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I(ከ gDNase ጋር)(Super Premix for first-strand cDNA synthesis from lncRNA) አምራች እና አቅራቢ |Foregene (foreivd.com)

ቻይና ሪል ጊዜ PCR Easyᵀᴹ-ታቅማን አምራች እና አቅራቢ |Foregene (foreivd.com)