• PCR ዲኤንኤን ከትንሽ የዲኤንኤ አብነት ለመጨመር የሚያገለግል ዘዴ ነው።RT-PCR የዲኤንኤ አብነት ከአር ኤን ኤ ምንጭ ለማምረት የተገላቢጦሽ ግልባጭ ይጠቀማል ከዚያም ሊሰፋ ይችላል።
• PCR እና RT-PCR በተለምዶ የመጨረሻ ነጥብ ምላሾች ሲሆኑ qPCR እና RT-qPCR በ PCR ምላሽ ጊዜ ያለውን የአብነት መጠን ለመለካት የምርት ውህደት መጠን ኪነቲክስ ይጠቀማሉ።
• እንደ ዲጂታል PCR ያሉ አዳዲስ ዘዴዎች የመጀመርያውን የዲኤንኤ አብነት ፍፁም መጠን ይሰጣሉ፣ እንደ አይዞተርማል PCR ያሉ ዘዴዎች አስተማማኝ ውጤቶችን ለማቅረብ ውድ መሣሪያዎችን አስፈላጊነት ይቀንሳሉ።

የ polymerase chain reaction (PCR) የዲ ኤን ኤ እና አር ኤን ኤ ቅደም ተከተሎችን ለመጨመር እና ለመለየት በአንፃራዊነት ቀላል እና በስፋት ጥቅም ላይ የዋለ ሞለኪውላር ባዮሎጂ ዘዴ ነው።ብዙ ጊዜ ቀናት ሊወስድ ከሚችለው የዲኤንኤ ክሎኒንግ እና ማጉላት ባህላዊ ዘዴዎች ጋር ሲነጻጸር PCR ጥቂት ሰዓታትን ብቻ ይፈልጋል።PCR በጣም ሚስጥራዊነት ያለው እና የተወሰኑ ቅደም ተከተሎችን ለማወቅ እና ለማጉላት አነስተኛውን አብነት ይፈልጋል።መሰረታዊ የ PCR ዘዴዎች ከቀላል ዲ ኤን ኤ እና አር ኤን ኤ ማወቂያ የበለጠ የላቁ ናቸው።ከዚህ በታች የተለያዩ PCR ዘዴዎችን እና በኤንዞ ላይፍ ሳይንስ ለምርምር ፍላጎቶችዎ የምንሰጣቸውን ሬጀንቶች አጠቃላይ እይታ አቅርበናል።እኛ ሳይንቲስቶች በሚቀጥለው የምርምር ፕሮጄክታቸው ውስጥ ለመጠቀም የ PCR ሬጀንቶችን በፍጥነት እንዲያገኙ ለማገዝ ዓላማችን ነው!

PCR

ለመደበኛ PCR፣ የሚያስፈልግህ የዲኤንኤ ፖሊመሬሴ፣ ማግኒዚየም፣ ኑክሊዮታይድ፣ ፕሪመርሮች፣ የዲኤንኤ አብነት ለማጉላት እና ቴርሞሳይክል ብቻ ነው።የ PCR ዘዴ እንደ አላማው ቀላል ነው፡ 1) ድርብ-ክር ያለው ዲኤንኤ (ዲኤስዲኤንኤ) ሙቀት የተከፈለ ነው፣ 2) ፕሪመርሮች ወደ ነጠላ የዲ ኤን ኤ ክሮች የተስተካከሉ ናቸው፣ እና 3) ፕሪመሮች በዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ የተራዘሙ ሲሆን ይህም ሁለት ቅጂዎች አሉት። ኦሪጅናል የዲ ኤን ኤ ገመድ።በተከታታይ ሙቀቶች እና ጊዜዎች ላይ የመደንዘዝ፣ የመደንዘዝ እና የማራዘም ሂደት አንድ የማጉላት ዑደት በመባል ይታወቃል (ምስል 1)።

እያንዳንዱ የዑደቱ ደረጃ ለአብነት እና ለፕሪመር ስብስብ ማመቻቸት አለበት።ይህ ዑደት በግምት ከ20-40 ጊዜ ያህል ይደገማል፣ እና የተጨመረው ምርት ሊተነተን ይችላል፣ በተለይም በአጋሮዝ ጄል (ምስል 2)።

PCR በጣም ስሜታዊነት ያለው ዘዴ ስለሆነ እና ለነጠላ ምላሾች በጣም ትንሽ ጥራዞች ስለሚያስፈልጉ ለብዙ ምላሾች ዋና ድብልቅ ማዘጋጀት ይመከራል።ዋናው ድብልቅ በደንብ የተደባለቀ እና ከዚያም በምላሾች ብዛት መከፋፈል አለበት, ይህም እያንዳንዱ ምላሽ ተመሳሳይ መጠን ያለው ኢንዛይም, ዲኤንቲፒ እና ፕሪመርስ ይይዛል.እንደ ኤንዞ ላይፍ ሳይንሶች ያሉ ብዙ አቅራቢዎች ከፕሪመር እና ከዲኤንኤ አብነት በስተቀር ሁሉንም ነገር የያዙ PCR ድብልቆችን ያቀርባሉ።

የጓኒን/ሳይቶሲን የበለጸጉ (ጂሲ-ሪች) ክልሎች በመደበኛ PCR ቴክኒኮች ላይ ፈተናን ይወክላሉ።በጂሲ የበለጸጉ ቅደም ተከተሎች ዝቅተኛ የጂሲ ይዘት ካላቸው ቅደም ተከተሎች የበለጠ የተረጋጉ ናቸው።በተጨማሪም የጂሲ-የበለፀጉ ቅደም ተከተሎች እንደ የፀጉር ማያያዣ ቀለበቶች ያሉ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅሮችን ይፈጥራሉ።በውጤቱም ፣ በጂሲ የበለፀጉ ድርብ ክሮች በ denaturation ደረጃ ውስጥ ሙሉ በሙሉ ለመለየት አስቸጋሪ ናቸው።ስለዚህ፣ ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ አዲሱን ፈትል ያለምንም እንቅፋት ሊፈጥር አይችልም።ከፍ ያለ የሙቀት መጠን መጨመር ይህንን ሊያሻሽል ይችላል ፣ እና ከፍ ወዳለ የሙቀት መጠን ማስተካከያ እና አጭር የማስታመም ጊዜ በጂሲ የበለፀጉ ፕሪመርሮች ላይ ልዩ ትስስር እንዳይፈጠር ይከላከላል።ተጨማሪ ሬጀንቶች በጂሲ የበለጸጉ ቅደም ተከተሎችን ማጉላት ይችላሉ።ዲኤምኤስኦ፣ ግሊሰሮል እና ቢታይን በጂሲ መስተጋብር ምክንያት የሚመጡትን ሁለተኛ ደረጃ አወቃቀሮችን ለማደናቀፍ ይረዳሉ እና በዚህም የሁለት ክሮች መለያየትን ያመቻቻሉ።

ትኩስ ጅምር PCR

ልዩ ያልሆነ ማጉላት በ PCR ወቅት ሊከሰት የሚችል ችግር ነው.ለ PCR ጥቅም ላይ የሚውሉት አብዛኛዎቹ የዲኤንኤ ፖሊመሬሴዎች ከ68°C እስከ 72°C ባለው የሙቀት መጠን ይሰራሉ።ኤንዛይም በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ምንም እንኳን ንቁ ሊሆን ይችላል.ከማደንዘዣው የሙቀት መጠን በጣም በታች በሆነ የሙቀት መጠን ፣ ምላሹ በበረዶ ላይ ቢዘጋጅም ፣ ፕሪመርስ ልዩ ባልሆነ ሁኔታ ማሰር እና ወደ ልዩ ያልሆነ ማጉያ ሊያመራ ይችላል።ይህንን መከላከል የሚቻለው የተወሰነ የሙቀት መጠን ከደረሰ በኋላ ብቻ ከዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ የሚለይ ፖሊሜሬሴን ኢንቢክተሮችን በመጠቀም ነው፣ ስለዚህም ትኩስ ጅምር PCR የሚለው ቃል።አጋቾቹ ፖሊመሬሴን እና ዲናቴሬቶችን የሚያገናኝ ፀረ እንግዳ አካል ሊሆን ይችላል በመነሻ የመደንዘዝ ሙቀት (በተለምዶ 95 ° ሴ)።

ከፍተኛ ታማኝነት ፖሊሜሬዝ

የዲኤንኤ ፖሊመሬሴዎች በትክክል ወደ መጀመሪያው የአብነት ቅደም ተከተል ሲጨምሩ፣ በኑክሊዮታይድ ማዛመድ ላይ ስህተቶች ሊከሰቱ ይችላሉ።እንደ ክሎኒንግ ባሉ አፕሊኬሽኖች ውስጥ ያሉ አለመዛመዶች የተቆራረጡ ግልባጮች፣ እና በተሳሳተ መንገድ የተተረጎሙ ወይም የቦዘኑ ፕሮቲኖችን ወደ ታች ሊያስከትሉ ይችላሉ።እነዚህን አለመዛመጃዎች ለማስወገድ የ "ማረም" ተግባር ያላቸው ፖሊመሮች ተለይተው በስራው ውስጥ ተካተዋል.የመጀመሪያው የማረሚያ ፖሊሜሬሴ, Pfu, በ 1991 በፒሮኮከስ ፉሪዮሰስ ተለይቷል.ይህ Pfu ኢንዛይም ከ3' እስከ 5' exonuclease እንቅስቃሴ አለው።ዲ ኤን ኤው እየሰፋ ሲሄድ ኤክሶኑክሊዝ በክርክሩ 3' ጫፍ ላይ ያልተዛመዱ ኑክሊዮታይዶችን ያስወግዳል።ትክክለኛው ኑክሊዮታይድ ተተክቷል, እና የዲ ኤን ኤ ውህደት ይቀጥላል.የተሳሳቱ የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተሎችን መለየት ከኤንዛይም ጋር ለትክክለኛው ኑክሊዮሳይድ ትራይፎስፌት ባለው ትስስር ላይ የተመሰረተ ነው, ይህም ውጤታማ ያልሆነ ትስስር ውህደትን ይቀንሳል እና ትክክለኛውን መተካት ያስችላል.የPfu polymerase የማረም እንቅስቃሴ በመጨረሻው ቅደም ተከተል ከTaq DNA polymerase ጋር ሲነጻጸር ጥቂት ስህተቶችን ያስከትላል።በቅርብ ዓመታት ውስጥ, ሌሎች የማረም ኢንዛይሞች ተለይተዋል, እና በዲኤንኤ ማጉላት ወቅት የስህተት መጠኑን የበለጠ ለመቀነስ በዋናው Pfu ኢንዛይም ላይ ማሻሻያዎች ተደርገዋል.

RT-PCR

PCR ወይም RT-PCR የተገላቢጦሽ ግልባጭ አር ኤን ኤ እንደ አብነት መጠቀም ያስችላል።አንድ ተጨማሪ እርምጃ አር ኤን ኤ ፈልጎ ማግኘት እና ማጉላት ያስችላል።አር ኤን ኤው በግልባጭ ወደ ተሟጋች ዲ ኤን ኤ (ሲዲኤንኤ) ተገልብጧል፣ በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴስ በመጠቀም።የ RNA አብነት ጥራት እና ንፅህና ለ RT-PCR ስኬት አስፈላጊ ናቸው።የ RT-PCR የመጀመሪያው እርምጃ የዲኤንኤ/አር ኤን ኤ ዲቃላ ውህደት ነው።የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ እንዲሁ የ RNase H ተግባር አለው፣ እሱም የድብልቅ አር ኤን ኤ ክፍልን ዝቅ ያደርገዋል።ነጠላ-ክር ያለው የዲ ኤን ኤ ሞለኪውል በዲኤንኤ ላይ የተመሰረተ የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬሴ እንቅስቃሴ በግልባጭ ትራንስክሪፕት ወደ ሲዲኤንኤ ይጠናቀቃል።የመጀመሪያው-ክር ምላሽ ውጤታማነት የማጉላት ሂደቱን ሊጎዳ ይችላል.ከዚህ በመነሳት, መደበኛ PCR አሠራር ሲዲኤንኤን ለማጉላት ጥቅም ላይ ይውላል.በ RT-PCR አር ኤን ኤ ወደ ሲዲ ኤን ኤ የመመለስ እድሉ ብዙ ጥቅሞች አሉት እና በዋናነት ለጂን አገላለጽ ትንተና ይጠቅማል።አር ኤን ኤ ነጠላ-ክር እና በጣም ያልተረጋጋ ነው, ይህም አብሮ ለመስራት ፈታኝ ያደርገዋል.እሱ በተለምዶ በ qPCR ውስጥ እንደ የመጀመሪያ እርምጃ ሆኖ ያገለግላል ፣ እሱም የአር ኤን ኤ ግልባጮችን በባዮሎጂካል ናሙና ይቆጥራል።

qPCR እና RT-qPCR

Quantitative PCR (qPCR) ለብዙ አፕሊኬሽኖች ኑክሊክ አሲዶችን ለመለየት፣ ለመለየት እና ለመለካት ይጠቅማል።በRT-qPCR፣ የአር ኤን ኤ ግልባጮች በብዛት የሚለካው በመጀመሪያ ወደ ሲዲኤንኤ በመገልበጥ ነው፣ ከላይ እንደተገለጸው፣ እና በመቀጠል qPCR በቀጣይነት ይከናወናል።እንደ መደበኛ PCR፣ ዲ ኤን ኤ በሦስት ተደጋጋሚ ደረጃዎች ይጨመራል፡ ዴንታሬሽን፣ ማደንዘዣ እና ማራዘም።ነገር ግን፣ በqPCR ውስጥ፣ PCR እየገፋ ሲሄድ የፍሎረሰንት መለያ መረጃን መሰብሰብ ያስችላል።ይህ ዘዴ በተለያዩ ዘዴዎች እና ኬሚስትሪዎች ምክንያት ብዙ ጥቅሞች አሉት.

በቀለም ላይ የተመሰረተ qPCR (በተለምዶ አረንጓዴ)፣ የፍሎረሰንት መለያ የዲኤስዲኤን ማሰሪያ ቀለም በመጠቀም የተጨመሩትን የዲ ኤን ኤ ሞለኪውሎች ለመለካት ያስችላል።በእያንዳንዱ ዑደት ውስጥ ፍሎረሰንት ይለካል.የፍሎረሰንት ምልክት ከተደጋገመ ዲ ኤን ኤ መጠን ጋር በተመጣጣኝ መጠን ይጨምራል።ስለዚህም ዲ ኤን ኤው የሚለካው በ "እውነተኛ ጊዜ" ነው (ምስል 3)።በቀለም ላይ የተመሰረተ qPCR ጉዳቶቹ በአንድ ጊዜ አንድ ዒላማ ብቻ ሊመረመሩ ይችላሉ እና ማቅለሙ በናሙናው ውስጥ ካለ ማንኛውም ዲ ኤን ኤ ጋር ይያያዛል።

በምርመራ ላይ በተመሰረተ qPCR፣ ብዙ ኢላማዎች በእያንዳንዱ ናሙና ውስጥ በአንድ ጊዜ ሊገኙ ይችላሉ፣ ነገር ግን ይህ ከፕሪመርሮች በተጨማሪ ጥቅም ላይ የሚውል ኢላማ-ተኮር መጠይቅ(ዎች) ማመቻቸት እና ዲዛይን ያስፈልገዋል።በርካታ አይነት የመመርመሪያ ዲዛይኖች ይገኛሉ፣ ግን በጣም የተለመደው አይነት ፍሎሮፎር እና quencher የሚያጠቃልለው የሃይድሮሊሲስ ፍተሻ ነው።ፍተሻው ሳይበላሽ ሳለ የፍሎረሰንስ ድምጽ ማጉያ ሃይል ማስተላለፊያ (FRET) የፍሎረፎሩን ልቀትን በኪንቸር በኩል ይከላከላል።ነገር ግን፣ በ PCR ምላሽ ወቅት፣ ፍተሻው በፕሪምየር ማራዘሚያ እና የተወሰነውን ቅደም ተከተል በማጉላት ጊዜ በሃይድሮላይዝድ ይደረጋል።የፍተሻው መሰንጠቅ ፍሎሮፎሩን ከኩንቸር ይለያል እና በማጉላት ላይ የተመሰረተ የፍሎረሰንት መጨመር ያስከትላል (ምስል 4).ስለዚህ፣ በምርመራ ላይ የተመሰረተ የqPCR ምላሽ የፍሎረሰንስ ምልክት በናሙናው ውስጥ ካለው የፍተሻ ዒላማ ቅደም ተከተል መጠን ጋር ተመጣጣኝ ነው።በምርመራ ላይ የተመሰረተ qPCR በቀለም ላይ ከተመሠረተ qPCR የበለጠ የተለየ ስለሆነ፣ ብዙ ጊዜ በqPCR ላይ በተመሰረተ የምርመራ ሙከራዎች ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውለው ቴክኖሎጂ ነው።

Isothermal ማጉላት

ከላይ የተጠቀሰው PCR ቴክኒኮችን ለ denaturation፣ አነቃቂ እና የኤክስቴንሽን ደረጃዎች የክፍል ሙቀትን በትክክል ከፍ እና ዝቅ ለማድረግ ውድ የሆኑ ቴርሞሳይክል መሳሪያዎችን ይፈልጋል።እንደነዚህ ያሉ ትክክለኛ መሣሪያዎችን የማይፈልጉ እና በቀላል የውሃ መታጠቢያ ውስጥ ወይም በፍላጎት ሴሎች ውስጥ እንኳን ሊከናወኑ የሚችሉ በርካታ ዘዴዎች ተዘጋጅተዋል.እነዚህ ቴክኒኮች በጋራ ኢሶተርማል ማጉላት ይባላሉ እና በገለፃ ፣በላይነር ወይም በካስኬድ ማጉላት ላይ የተመሰረቱ ናቸው።

በጣም የታወቀው የኢሶተርማል ማጉላት በ loop-mediated isothermal amplification ወይም LAMP ነው።አብነት ዲኤንኤ ወይም አር ኤን ለማጉላት LAMP ገላጭ ማጉላትን በ65⁰C ይጠቀማል።LAMPን በሚሰሩበት ጊዜ፣ ከተፈለገው ዲኤንኤ ክልሎች ጋር የሚደጋገፉ ከአራት እስከ ስድስት ፕሪመር ከዲኤንኤ ፖሊሜሬዝ ጋር አዲስ ዲኤንኤን ለማዋሃድ ያገለግላሉ።ከእነዚህ ፕሪመርዎች ውስጥ ሁለቱ የሌሎቹ ፕሪመር ውስጥ ያሉትን ቅደም ተከተሎች የሚያውቁ እና እርስ በርስ የሚተሳሰሩ ተከታታይ ቅደም ተከተሎች አሏቸው፣ ይህም አዲስ በተሰራው ዲ ኤን ኤ ውስጥ የ"loop" መዋቅር እንዲፈጠር ያስችለዋል፣ ይህም በቀጣይ የማጉላት ዙሮች ውስጥ ፕሪመርን ለማስወገድ ይረዳል።LAMP በበርካታ ዘዴዎች ሊታይ ይችላል, ፍሎረሰንስ, አጋሮሴ ጄል ኤሌክትሮፊዮሬሲስ ወይም ኮሎሪሜትሪ ጨምሮ.የምርቱን መኖር እና አለመገኘት በቀለም የማየት እና የመለየት ቀላልነት እና የሚፈለገው ውድ መሳሪያ እጥረት LAMP ክሊኒካዊ የላቦራቶሪ ምርመራ በቀላሉ በማይገኝባቸው አካባቢዎች ለ SARS-CoV-2 ምርመራ ተስማሚ አማራጭ አድርጎታል ወይም ናሙናዎችን ማከማቸት እና ማጓጓዝ የሚቻል አልነበረም፣ ወይም ከዚህ ቀደም PCR ቴርሞሳይክል መሳሪያ በሌላቸው ቤተ ሙከራዎች ውስጥ።