1. መሰረታዊ እውቀት (የሙከራውን ክፍል ማየት ከፈለጉ እባክዎን በቀጥታ ወደ ሁለተኛው ክፍል ያስተላልፉ)

እንደ ተለምዷዊ PCR የመነሻ ምላሽ፣ የሪል ታይም ፒሲአር በዋናነት በእያንዳንዱ የፒሲአር ማጉላት ምላሽ በእያንዳንዱ ዑደት ውስጥ ያለውን የማጉላት ምርት መጠን በእውነተኛ ጊዜ በፍሎረሰንስ ሲግናል ለውጥ ይከታተላል እና የመነሻውን አብነት በመጠን በሲቲ እሴት እና በመደበኛ ከርቭ መካከል ባለው ግንኙነት ይተነትናል።

የ RT-PCR ልዩ ውሂብ ናቸው።መነሻ መስመር, የፍሎረሰንት ገደብእናየሲቲ እሴት

ለ RT-PCR የተለመዱ የመለያ ዘዴዎች፡-

2. የሙከራ ደረጃዎች

2.1 ስለ የሙከራ ስብስብ- በቡድኑ ውስጥ ብዙ ጉድጓዶች ሊኖሩ ይገባል, እና ባዮሎጂያዊ ድግግሞሽ መሆን አለበት.

2.2 የፕሪመር ንድፍ መርሆዎች

①ሲአርኤንኤ በዘር ላይ የተመሰረተ ነው, እና የተለያዩ ዝርያዎች ቅደም ተከተል የተለየ ይሆናል.

②ሲአርኤን በደረቀ ዱቄት የታሸገ ሲሆን ይህም በክፍል ሙቀት ለ2-4 ሳምንታት በተረጋጋ ሁኔታ ሊከማች ይችላል።

2.3 አስቀድመው መዘጋጀት ያለባቸው መሳሪያዎች ወይም ሬጀንቶች

2.4 በልዩ የሙከራ ደረጃዎች ውስጥ ትኩረት ሊሰጣቸው የሚገቡ ጉዳዮችን በተመለከተ፡-

①siRNA የመተላለፍ ሂደት

1. ለመለጠፍ 24-ጉድጓድ ሳህን ፣ 12-ጉድጓድ ሳህን ወይም 6-ጉድጓድ ሳህን መምረጥ ይችላሉ (በ 24-ጉድጓድ ሳህን ውስጥ በእያንዳንዱ የውሃ ጉድጓድ ውስጥ የቀረበው አማካይ የአር ኤን ኤ ክምችት ከ100-300 NG / uL ነው) እና የሴሎች ጥሩ የመተላለፊያ ጥግግት እስከ 60% -80% ወይም ከዚያ በላይ ነው።

2. የዝውውር ደረጃዎች እና የተወሰኑ መስፈርቶች በመመሪያው መሰረት በጥብቅ ናቸው.

3. ከተዛወረ በኋላ ናሙናዎችን በ24-72 ሰአታት ውስጥ ለኤምአርኤን ማወቂያ (RT-PCR) ወይም ፕሮቲን በ48-96 ሰአታት ውስጥ መሰብሰብ ይቻላል (WB)

② አር ኤን ኤ ማውጣት ሂደት

1. በውጫዊ ኢንዛይሞች መበከልን ይከላከሉ.በዋናነት ጭምብል እና ጓንት ማድረግን በጥብቅ ያካትታል;sterilized pipette ምክሮችን እና EP ቱቦዎች በመጠቀም;በሙከራው ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውለው ውሃ ከ RNase-ነጻ መሆን አለበት.

2. በፈጣን የማስወጫ ኪት ውስጥ በተጠቆመው መሰረት ሁለት ጊዜ እንዲደረግ ይመከራል, ይህም ንፅህናን እና ምርትን በእውነት ያሻሽላል.

3. የቆሻሻ ፈሳሹ የ RNA አምድ መንካት የለበትም.

③ አር ኤን ኤ መጠን

አር ኤን ኤ ከተወጣ በኋላ በቀጥታ በናኖድሮፕ ሊለካ ይችላል፣ እና ዝቅተኛው ንባብ እስከ 10ng/ul ዝቅተኛ ሊሆን ይችላል።

④ የጽሑፍ ግልባጭ ሂደት

1. በ RT-qPCR ከፍተኛ ስሜታዊነት ምክንያት ለእያንዳንዱ ናሙና ቢያንስ 3 ትይዩ ጉድጓዶች መደረግ አለባቸው ተከታዩ Ct በጣም የተለየ እንዳይሆን ወይም ኤስዲው ለስታቲስቲክስ ትንተና በጣም ትልቅ እንዳይሆን።

2. አትቀዘቅዙ እና የማስተር ድብልቅን ደጋግመው አይቀልጡት።

3. እያንዳንዱ ቱቦ/ቀዳዳ በአዲስ ጫፍ መተካት አለበት!ናሙናዎችን ለመጨመር ተመሳሳይ የ pipette ጫፍን ያለማቋረጥ አይጠቀሙ!

4. ናሙናውን ከጨመረ በኋላ በ 96 ጉድጓድ ላይ የተጣበቀው ፊልም በጠፍጣፋ ማረም ያስፈልጋል.በቧንቧ ግድግዳ ላይ ያለው ፈሳሽ ወደታች እንዲፈስ እና የአየር አረፋዎችን ለማስወገድ በማሽኑ ላይ ከማስቀመጥዎ በፊት ሴንትሪፉል ማድረግ ጥሩ ነው.

⑤የጋራ ኩርባ ትንተና

2.5 ስለ መረጃ ትንተና

የqPCR መረጃ ትንተና ወደ አንጻራዊ አሃዛዊ እና ፍፁም አሃዝ ሊከፋፈል ይችላል።ለምሳሌ, በሕክምና ቡድን ውስጥ ያሉ ሴሎች በቁጥጥር ቡድን ውስጥ ካሉ ሴሎች ጋር ሲወዳደሩ,

የ X ጂን mRNA ስንት ጊዜ ይለወጣል, ይህ አንጻራዊ መጠን ነው;በተወሰኑ የሴሎች ቁጥር, የ X ጂን mRNA

ምን ያህል ቅጂዎች አሉ, ይህ ፍጹም መጠን ነው.አብዛኛውን ጊዜ በቤተ ሙከራ ውስጥ የምንጠቀመው አንጻራዊ የቁጥር ዘዴ ነው።በተለምዶ፣የ 2-ΔΔct ዘዴበሙከራዎች ውስጥ በብዛት ጥቅም ላይ ይውላል, ስለዚህ ይህ ዘዴ ብቻ እዚህ በዝርዝር ይተዋወቃል.

2-ΔΔct ዘዴ: የተገኘው ውጤት በሙከራ ቡድን ውስጥ ካለው የጂን ዘረ-መል (ጅን) ጋር ሲነፃፀር በክትትል ቡድን ውስጥ ያለው ልዩነት ነው.የሁለቱም የታለመው ዘረ-መል እና የውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂን የማጉላት ቅልጥፍና ወደ 100% የሚጠጋ ሲሆን አንጻራዊው ልዩነት ከ 5% መብለጥ የለበትም.

የማስላት ዘዴው እንደሚከተለው ነው.

Δct የቁጥጥር ቡድን = በቁጥጥር ቡድን ውስጥ የዒላማ ዘረ-መል (CT) እሴት - በቁጥጥር ቡድን ውስጥ የውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂን ct እሴት

Δct የሙከራ ቡድን = በሙከራ ቡድን ውስጥ ያለው የታለመው ዘረ-መል (CT) እሴት - በሙከራ ቡድን ውስጥ ያለው የውስጣዊ ማመሳከሪያ ጂን ሲቲ እሴት

ΔΔct=Δct የሙከራ ቡድን-Δct መቆጣጠሪያ ቡድን

በመጨረሻም፣ በገለፃ ደረጃ ያለውን የልዩነት ብዜት አስሉ፡

ማጠፍ=2-ΔΔct ቀይር (ከኤክሴል ተግባር ጋር የሚዛመደው POWER ነው)

ተዛማጅ ምርቶች፡

የሕዋስ ቀጥታ RT-qPCR ስብስብ