የምላሽ ስርዓት ትብነት መጨመር;

1. ከፍተኛ ጥራት ያለው አር ኤን ኤ ማግለል;

ስኬታማ የሲዲኤንኤ ውህደት የሚመጣው ከፍተኛ ጥራት ካለው አር ኤን ኤ ነው።ከፍተኛ ጥራት ያለው አር ኤን ኤ ቢያንስ ሙሉ ርዝመት ያለው እና እንደ EDTA ወይም SDS ካሉ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴስ አጋቾች የጸዳ መሆን አለበት።የአር ኤን ኤ ጥራት ወደ ሲዲኤንኤ መገልበጥ የሚችሉትን ከፍተኛውን የቅደም ተከተል መረጃ መጠን ይወስናል።የተለመደ የአር ኤን ኤ የመንጻት ዘዴ ጓኒዲን ኢሶቲዮኬኔት/አሲድ ፌኖልን በመጠቀም አንድ-ደረጃ ዘዴ ነው።በ RNase መጠን መበከልን ለመከላከል፣ አር ኤን ኤ ከ RNase የበለጸጉ ናሙናዎች (እንደ ቆሽት ያሉ) የተነጠለውን አር ኤን ኤ ከፍተኛ ጥራት ያለው አር ኤን ኤ ለማቆየት በተለይም ለረጅም ጊዜ ማከማቻነት በፎርማለዳይድ ውስጥ መቀመጥ አለበት።ከአይጥ ጉበት የሚወጣው አር ኤን ኤ በመሠረቱ ለአንድ ሳምንት ያህል በውሃ ውስጥ ከተከማቸ በኋላ የተበላሸ ሲሆን ከአይጥ ስፕሊን የወጣው አር ኤን ኤ ደግሞ ለ3 ዓመታት በውሃ ውስጥ ከተከማቸ በኋላ የተረጋጋ ሆኖ ቆይቷል።በተጨማሪም፣ ከ4 ኪ.ባ በላይ የሚረዝሙ ግልባጮች ከትንንሽ ግልባጮች ይልቅ በ RNases መበላሸት የበለጠ ስሜታዊ ናቸው።የተከማቹ አር ኤን ኤ ናሙናዎችን መረጋጋት ለመጨመር አር ኤን ኤ በዲዮኒዝድ ፎርማሚድ ውስጥ ሊሟሟ እና በ -70 ° ሴ ሊከማች ይችላል.አር ኤን ኤ ለመጠበቅ ጥቅም ላይ የሚውለው ፎርማሚድ አር ኤን ኤ ከሚያበላሹ ፍርስራሾች የጸዳ መሆን አለበት።ከቆሽት የሚገኘው አር ኤን ኤ ቢያንስ ለአንድ አመት በፎርማሚድ ውስጥ ሊቀመጥ ይችላል።አር ኤን ኤን ለመጠቀም በሚዘጋጅበት ጊዜ አር ኤን ኤ ለማመንጨት የሚከተለውን ዘዴ መጠቀም ይችላሉ፡-NaCl ወደ 0.2M እና 4 ጊዜ የኢታኖል መጠን ይጨምሩ፣በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ3-5 ደቂቃ ያስቀምጡ እና በ10,000×g ለ5 ደቂቃ ሴንትሪፉጅ ያድርጉ።

2. የ RNaseH-የቦዘነ (RNaseH-) ተቃራኒ ትራንስክሪፕት ይጠቀሙ፡-

RNase inhibitors ብዙውን ጊዜ የሲዲኤንኤ ውህደትን ርዝመት እና ምርት ለመጨመር ወደ ግልባጭ ግልባጭ ምላሾች ይታከላሉ።RNase inhibitors በአንደኛው-ክር ውህድ ምላሽ ጊዜ ቋት እና የሚቀንስ ኤጀንት (እንደ ዲቲቲ) ባሉበት ጊዜ መጨመር አለባቸው ምክንያቱም ከሲዲኤንኤ ውህደት በፊት ያለው ሂደት አጋቾቹን ስለሚሰርዝ አር ኤን ኤን ሊያበላሽ የሚችል የታሰረ RNase ይለቀቃል።ፕሮቲን አር ናስ አጋቾች አር ኤን ኤ ፣ ቢ ፣ ሲ በ አር ኤን ኤ መበላሸትን ብቻ ይከላከላሉ እና RNase በቆዳ ላይ አይከላከሉም ፣ ስለሆነም እነዚህን አጋቾቹ ቢጠቀሙም RNase ን ከጣቶችዎ እንዳያስገቡ ይጠንቀቁ።

የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ አር ኤን ኤ ወደ ሲዲኤንኤ መለወጥን ያበረታታል።ሁለቱም M-MLV እና AMV ከራሳቸው የ polymerase እንቅስቃሴ በተጨማሪ ውስጣዊ የ RNaseH እንቅስቃሴ አላቸው።የ RNaseH እንቅስቃሴ እና የ polymerase እንቅስቃሴ በአር ኤን ኤ አብነት እና በዲኤንኤ ፕሪመር ወይም በሲዲኤንኤ ኤክስቴንሽን ፈትል መካከል ለተፈጠረው ድቅል ፈትል እርስ በርስ ይወዳደራሉ፣ እና በአር ኤን ኤ፡ ዲ ኤን ኤ ውስብስብ ውስጥ ያለውን የአር ኤን ኤ ፈትል ያዋርዳሉ።በRNaseH እንቅስቃሴ የተበላሸው የአር ኤን ኤ አብነት ለcDNA ውህድ እንደ ውጤታማ መገኛ ሆኖ ሊያገለግል አይችልም፣ ይህም የሲዲኤን ውህደት ምርት እና ርዝመትን ይቀንሳል።ስለዚህ፣ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴስን የ RNaseH እንቅስቃሴ ማስወገድ ወይም በእጅጉ መቀነስ ጠቃሚ ነው።

ሱፐር ስክሪፕት Ⅱ የተገላቢጦሽ ግልባጭ፣ RNaseH- MMLV በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴ እና ቴርሞስክሪፕት በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴ፣ RNaseH- AMV፣ ከ MMLV እና AMV የበለጠ መጠን እና ሙሉ ርዝመት ያለው ሲዲኤንኤ ማግኘት ይችላል።የ RT-PCR ትብነት በሲዲኤንኤ ውህደት መጠን ይጎዳል።ቴርሞስክሪፕት ከ AMV የበለጠ ስሜታዊ ነው።የRT-PCR ምርቶች መጠን የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትዝ ሲዲኤንኤን የማዋሃድ ችሎታ የተገደበ ነው፣በተለይ ትላልቅ ሲዲኤንኤዎችን በሚዘጉበት ጊዜ።ከኤምኤምኤልቪ ጋር ሲነጻጸር፣ SuperScripⅡ የረጅም RT-PCR ምርቶችን ምርት በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል።የ RNaseH-reverse transcriptase በተጨማሪም ቴርሞስታቴሽን ጨምሯል, ስለዚህ ምላሹ ከተለመደው 37-42 ° ሴ በሚበልጥ የሙቀት መጠን ሊከናወን ይችላል.በተጠቆሙት የውህደት ሁኔታዎች፣ oligo(dT) primer እና 10 μCi of [α-P] dCTP ይጠቀሙ።የመጀመርያው ስትራንድ ጠቅላላ ምርት በቲሲኤ የዝናብ ዘዴ በመጠቀም ይሰላል።ባለ ሙሉ ርዝመት ሲዲኤንኤ የተተነተነው በመጠን የተደረደሩ ባንዶች ተቆርጠው በአልካላይን አጋሮዝ ጄል ላይ ተቆጥረዋል።

3. ለተገላቢጦሽ ግልባጭ የመቀየሪያውን ሙቀት ያሳድጉ፡

ከፍ ያለ የሙቀት መጠን የአር ኤን ኤ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅርን ለመክፈት ይረዳል, የምላሹን ምርት ይጨምራል.ለአብዛኛዎቹ አር ኤን ኤ አብነቶች አር ኤን ኤውን እና ፕሪመርን በ65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ያለ ቋት ወይም ጨው ማፍለቅ፣ ከዚያም በበረዶ ላይ በፍጥነት ማቀዝቀዝ አብዛኞቹን ሁለተኛ ደረጃ ህንጻዎች ያስወግዳል እና ፕሪምሮች እንዲታሰሩ ያስችላቸዋል።ሆኖም አንዳንድ አብነቶች አሁንም የሙቀት denaturation በኋላ እንኳ ሁለተኛ መዋቅሮች አላቸው.የእነዚህን አስቸጋሪ አብነቶች ማጉላት ThermoScript Reverse Transcriptase በመጠቀም እና የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምላሽን ከፍ ባለ የሙቀት መጠን በማስቀመጥ ማጉላትን ማሻሻል ይቻላል።ከፍ ያለ የመታቀፊያ ሙቀቶች ልዩነትን ሊጨምር ይችላል፣ በተለይም ጂን-ተኮር ፕሪመር (ጂኤስፒ) ለሲዲኤንአ ውህደት ጥቅም ላይ ሲውል (ምዕራፍ 3 ይመልከቱ)።ጂኤስፒን የሚጠቀሙ ከሆነ የፕሪመርሮቹ ቲም ከሚጠበቀው የሙቀት መጠን ጋር አንድ አይነት መሆኑን ያረጋግጡ።oligo(dT) እና የዘፈቀደ ፕሪመር ከ60°ሴ በላይ አይጠቀሙ።የዘፈቀደ ፕሪመርሮች ወደ 60 ° ሴ ከመጨመራቸው በፊት በ 25 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ለ 10 ደቂቃዎች መፈልፈልን ይጠይቃሉ.ከፍ ያለ የተገላቢጦሽ የሙቀት መጠን ከመጠቀም በተጨማሪ አር ኤን ኤ/ፕሪመር ድብልቅን ከ65°ሴ ዲናቱሬሽን የሙቀት መጠን ወደ ተገላቢጦሽ የመቀየሪያ የሙቀት መጠን በቀጥታ በማስተላለፍ እና ቅድመ-ሞቅ ያለ 2× ምላሽ ድብልቅ (የሲዲኤንኤ ትኩስ ጅምር ውህድ) በመጨመር ልዩነቱን ማሻሻል ይቻላል።ይህ አቀራረብ በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ውስጥ የሚከሰተውን ኢንተርሞለኩላር ቤዝ ጥንድን ለመከላከል ይረዳል.ለ RT-PCR የሚያስፈልገው ባለብዙ ሙቀት መቀያየር የሙቀት ዑደትን በመጠቀም ማቅለል ይቻላል.

Tth ቴርሞስታብል ፖሊመሬሴ በMg2+ ፊት እና እንደ ኤን ኤ ፖሊመሬሴስ እንደ ኤን 2+ ፊት ይሰራል።በ 65 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ከፍተኛ ሙቀት ውስጥ ሊሞቅ ይችላል.ነገር ግን፣ በ PCR ወቅት Mn2+ መኖሩ ታማኝነትን ይቀንሳል፣ ይህም Tth polymerase ለከፍተኛ ትክክለኛነት ማጉላት ተስማሚ ያልሆነ ያደርገዋል፣ ለምሳሌ የ cDNA ክሎኒንግ።በተጨማሪም Tth ዝቅተኛ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቅልጥፍና ያለው ሲሆን ይህም ስሜትን ይቀንሳል, እና በግልባጭ መገለባበጥ እና PCR በአንድ ኢንዛይም ሊከናወን ስለሚችል, የተገላቢጦሽ ግልባጭ የሌላቸው የቁጥጥር ምላሾች የሲዲኤንኤ ማጉያ ምርቶችን ከብክለት ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ጋር ማወዳደር አይቻልም.የማጉላት ምርቶች ተለያይተዋል.

4. የተገላቢጦሽ ግልባጭን የሚያበረታቱ ተጨማሪዎች፡

ግሊሰሮል እና ዲኤምኤስኦን ጨምሮ ተጨማሪዎች ወደ የመጀመሪያው-ክር ውህደት ምላሽ ተጨምረዋል ፣ ይህም የኑክሊክ አሲድ ድርብ-ክርን መረጋጋት ሊቀንስ እና የአር ኤን ኤ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅርን ሊፈታ ይችላል።ሱፐር ስክሪፕት II ወይም ኤምኤምኤልቪ እንቅስቃሴን ሳይነካ እስከ 20% glycerol ወይም 10% DMSO ሊጨመር ይችላል።AMV እንቅስቃሴን ሳይቀንስ እስከ 20% ጋሊሰሮልን መቋቋም ይችላል።በሱፐር ስክሪፕትⅡ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምላሽ የ RT-PCR ስሜትን ከፍ ለማድረግ 10% ግሊሰሮል መጨመር እና በ 45 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ መጨመር ይቻላል ።ከተገላቢጦሽ ግልባጭ ምላሽ ምርት ውስጥ 1/10 ወደ PCR ከተጨመረ ፣በማጉላት ምላሽ ውስጥ ያለው የ glycerol ክምችት 0.4% ነው ፣ይህም PCRን ለመግታት በቂ አይደለም።

5. RNaseH ሕክምና;

ከ PCR በፊት የ cDNA ውህደት ግብረመልሶችን ከ RNaseH ጋር ማከም ስሜታዊነትን ይጨምራል።ለአንዳንድ አብነቶች፣ በሲዲኤንኤ ውህደት ውስጥ ያለው አር ኤን ኤ የማጉላት ምርቶችን መያያዝን ይከለክላል ተብሎ ይታሰባል፣ በዚህ ጊዜ የ RNaseH ህክምና ስሜትን ሊጨምር ይችላል።በአጠቃላይ የ RNaseH ህክምና የረዥም ጊዜ ሙሉ የሲዲኤንኤ ኢላማ አብነቶችን ሲያጎላ አስፈላጊ ነው፣ ለምሳሌ ዝቅተኛ ቅጂ ቲዩበርስ ሼሮሲስ II።ለዚህ አስቸጋሪ አብነት፣ የ RNaseH ህክምና በሱፐር ስክሪፕት II ወይም AMV-የተሰራ ሲዲኤንኤ የተሰራውን ምልክት አሻሽሏል።ለአብዛኛዎቹ የ RT-PCR ምላሾች፣ የ RNaseH ህክምና አማራጭ ነው፣ ምክንያቱም የ PCR የድጋፍ እርምጃ በ95°C በአጠቃላይ አር ኤን ኤውን በአር ኤን ኤ: ዲ ኤን ኤ ውስብስብነት ውስጥ ሃይድሮላይዝ ያደርጋል።

6. የአነስተኛ አር ኤን ኤ መፈለጊያ ዘዴን ማሻሻል;

በተለይ አነስተኛ መጠን ያለው አር ኤን ኤ ሲገኝ RT-PCR በጣም ፈታኝ ነው።በአር ኤን ኤ ሲገለል እንደ ተሸካሚ የተጨመረው ግሉኮጅን የትናንሽ ናሙናዎችን ምርት ለመጨመር ይረዳል።ትሪዞል ሲጨመር ከ RNase-ነጻ ግላይኮጅንን በአንድ ጊዜ መጨመር ይቻላል.ግሉኮጅን በውሃ ውስጥ የሚሟሟ ነው እና በአር ኤን ኤ ውስጥ በውሃ ውስጥ ሊቀመጥ ይችላል ለዝናብ ጊዜ።ከ 50 ሚሊ ግራም ቲሹ ወይም 106 የሰለጠኑ ህዋሶች ናሙናዎች፣ የሚመከረው የ RNase-free glycogen ክምችት 250 μg/ml ነው።

ሱፐር ስክሪፕት IIን በመጠቀም አሲቴላይትድ BSA ወደ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምላሽ መጨመር የስሜታዊነት ስሜትን ይጨምራል እና ለአነስተኛ አር ኤን ኤ መጠን የሱፐርስክሪፕት II መጠንን በመቀነስ 40 ዩኒት የ RNaseOut nuclease inhibitor መጨመር የመለየት ደረጃን ይጨምራል።በአር ኤን ኤ ማግለል ሂደት ውስጥ ግላይኮጅንን ጥቅም ላይ ከዋለ፣ ለተቃራኒ ጽሑፍ ምላሽ ሱፐር ስክሪፕት IIን ሲጠቀሙ አሁንም BSA ወይም RNase inhibitor እንዲጨምሩ ይመከራል።

ለምሳሌ፣ የRT-PCR ልዩነት ይጨምሩ

1. የ CND ውህደት;

የአንደኛ ደረጃ ሲዲኤንኤ ውህደት በሶስት የተለያዩ ዘዴዎች ሊጀመር ይችላል፣ አንጻራዊው ልዩነት በሲዲኤንኤ የተቀናጀ መጠን እና አይነት ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል።

የዘፈቀደ የፕሪመር ዘዴ ከሦስቱ ዘዴዎች ውስጥ በጣም ትንሹ የተለየ ነበር።ፕሪመርስ አጭር፣ ከፊል-ርዝመት ሲዲኤንኤዎችን በማመንጨት በተለያዩ ድረ-ገጾች የጽሑፍ ግልባጩን በሙሉ ያጠናክራል።ይህ ዘዴ የ5′ የመጨረሻ ቅደም ተከተሎችን ለማግኘት እና ሲዲኤንኤን ከኤንኤን አብነቶች ለማግኘት በሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ክልሎች ወይም በግልባጭ ትራንስክሪፕት ሊደገሙ የማይችሉ የማቋረጫ ጣቢያዎችን ለማግኘት ብዙ ጊዜ ጥቅም ላይ ይውላል።ረጅሙን ሲዲኤን ለማግኘት በእያንዳንዱ የአር ኤን ኤ ናሙና ውስጥ የፕሪመርስ እና አር ኤን ኤ መካከል ያለው ጥምርታ በተጨባጭ ሁኔታ መወሰን አለበት።የዘፈቀደ ፕሪመርስ የመነሻ ትኩረት በ 20 μl ምላሽ ከ 50 እስከ 250 ng.የዘፈቀደ ፕሪመርቶችን በመጠቀም ከጠቅላላ አር ኤን ኤ የተዋሃደው በዋናነት ራይቦሶማል አር ኤን ኤ ስለሆነ፣ ፖሊ(A)+RNA በአጠቃላይ እንደ አብነት ይመረጣል።

ኦሊጎ(ዲቲ) ፕሪመር ከዘፈቀደ ፕሪመር የበለጠ የተወሰኑ ናቸው።በአብዛኛዎቹ eukaryotic mRNAs 3′ መጨረሻ ላይ የሚገኘውን ወደ ፖሊ(A) ጅራት ያዳቅላል።ፖሊ(A)+ አር ኤን ኤ ከጠቅላላ አር ኤን ኤ ከ1% እስከ 2% ስለሚሆን፣የሲዲኤንኤ መጠን እና ውስብስብነት በዘፈቀደ ፕሪመርሮች በጣም ያነሰ ነው።በከፍተኛ ልዩነቱ ምክንያት፣ oligo(dT) በአጠቃላይ የአር ኤን ኤ እና ፕሪመርስ ጥምርታ እና የፖሊ(A)+ ምርጫ ማመቻቸትን አይፈልግም።በ 20μl ምላሽ ስርዓት 0.5μg oligo(dT) ለመጠቀም ይመከራል።oligo(dT)12-18 ለአብዛኛዎቹ RT-PCR ተስማሚ ነው።ቴርሞስክሪፕት RT-PCR ሲስተም ኦሊጎ (ዲቲ) 20 ያቀርባል ምክንያቱም ለከፍተኛ ሙቀት መጨመር የተሻለ የሙቀት መረጋጋት።

የጂን የተወሰነ ፕሪመር (ጂኤስፒ) ለተገላቢጦሽ ግልባጭ ደረጃ በጣም ልዩ ፕሪመርሮች ናቸው።ጂኤስፒ አንቲሴንስ ኦሊጎኑክሊዮታይድ ሲሆን በተለይ ወደ አር ኤን ኤ ዒላማ ቅደም ተከተል ማዳቀል የሚችል፣ እንደ የዘፈቀደ primers ወይም oligo(dT) ሳይሆን ሁሉንም አር ኤን ኤዎች የሚሰርዝ።PCR ፕሪመርቶችን ለመንደፍ ጥቅም ላይ የሚውሉ ተመሳሳይ ደንቦች ለጂኤስፒ ዲዛይን በተገላቢጦሽ ግልባጭ ምላሽ ላይ ተፈጻሚ ይሆናሉ።ጂኤስፒ ወደ ኤምአርኤንኤ 3′-በጣም ጫፍ ከሚሸጠው የማጉላት ፕሪመር ጋር ተመሳሳይ ቅደም ተከተል ሊሆን ይችላል ወይም ጂኤስፒ የተገላቢጦሽ ማጉያ ፕሪመርን ወደ ታች ለመቀልበስ የተነደፈ ሊሆን ይችላል።ለአንዳንድ የተራቀቁ ርዕሰ ጉዳዮች፣ ከአንድ በላይ አንቲሴንስ ፕሪመር ለስኬታማ RT-PCR መቅረጽ ያስፈልገዋል ምክንያቱም የዒላማው አር ኤን ኤ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር የፕሪመር ትስስርን ሊከላከል ይችላል።በ 20 μl የመጀመሪያ-ፈትል ውህደት ምላሽ 1 pmol antisense GSP ለመጠቀም ይመከራል።

2. ለተገላቢጦሽ ግልባጭ የመቀየሪያውን ሙቀት ያሳድጉ፡

የጂኤስፒ ስፔሲፊኬሽን ሙሉ ጥቅም ሙሉ በሙሉ ለመጠቀም፣ ከፍተኛ የሙቀት መቆጣጠሪያ ያለው የተገላቢጦሽ ግልባጭ ጥቅም ላይ መዋል አለበት።የአጸፋውን ጥብቅነት ለመጨመር ቴርሞስታት በግልባጭ የጽሑፍ ግልባጮች በከፍተኛ የሙቀት መጠን መከተብ ይችላሉ።ለምሳሌ፣ አንድ ጂኤስፒ በ55°ሴ ከጨመረ፣ AMV ወይም M-MLV በዝቅተኛ የ 37°C ግልባጭ ለግልባጭነት ከተጠቀሙ የጂኤስፒ ልዩነት ሙሉ በሙሉ ጥቅም ላይ አይውልም።ሆኖም ሱፐር ስክሪፕት II እና ቴርሞስክሪፕት በ 50 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና ከዚያ በላይ ምላሽ ሊሰጡ ይችላሉ, ይህም በዝቅተኛ የሙቀት መጠን የሚመነጩ ልዩ ያልሆኑ ምርቶችን ያስወግዳል.ለከፍተኛ ልዩነት፣ አር ኤን ኤ/ፕሪመር ድብልቅ በቀጥታ ከ65°ሴ ዲናቱሬሽን የሙቀት መጠን ወደ ተገላቢጦሽ የመቀየሪያ ሙቀት እና ወደ ቅድመ-ሞቅ ያለ 2× ምላሽ ድብልቅ (የሲዲኤንኤ ውህደት ትኩስ ጅምር) መጨመር ይችላል።ይህ በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ኢንተርሞለኪውላር ቤዝ ጥንዶችን ለመከላከል ይረዳል።ለ RT-PCR የሚያስፈልጉ ብዙ የሙቀት ሽግግሮች የሙቀት ዑደትን በመጠቀም ማቃለል ይቻላል.

3. የጂኖሚክ ዲኤንኤ ብክለትን ይቀንሳል።

ከ RT-PCR ጋር ሊያጋጥመው የሚችለው ችግር በአር ኤን ኤ ውስጥ ያለው የጂኖም ዲ ኤን ኤ መበከል ነው።እንደ ትሪዞል ሬጀንት ያሉ ጥሩ አር ኤን ኤ ማግለል ዘዴን በመጠቀም የአር ኤን ኤ ዝግጅትን የሚበክል የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ መጠን ይቀንሳል።ከጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ የተገኙ ምርቶችን ለማስቀረት፣ አር ኤን ኤ ወደ ግልብጥብጥ ከመደረጉ በፊት በዲ ኤን ኤ ላይ ብክለትን ለማስወገድ በማጉላት ደረጃ ዲ ኤን ኤ ሊታከም ይችላል።የDNase I መፈጨት የተቋረጠው ናሙናዎቹን በ2.0 ሚሜ EDTA ውስጥ ለ10 ደቂቃ በ65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ በመክተት ነው።ኤዲቲኤ የማግኒዚየም ionዎችን በማጣራት በከፍተኛ ሙቀት ማግኒዚየም ion-dependent RNA hydrolysis ይከላከላል።

አምፕሊፋይድ ሲዲኤንኤ ጂኖሚክ የዲኤንኤ ማጉላት ምርቶችን ከብክለት ለመለየት፣ እያንዳንዱ አነን exons እንዲለዩ ፕሪመር ሊነደፉ ይችላሉ።ከሲዲኤንኤ የሚመነጩ PCR ምርቶች ከብክለት ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ከተገኙት ያነሱ ይሆናሉ።በተጨማሪም፣ የተሰጠው ቁርጥራጭ ከጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ወይም ሲዲኤን የተገኘ መሆኑን ለማረጋገጥ በእያንዳንዱ አር ኤን ኤ አብነት ላይ የተገለባበጥ የቁጥጥር ሙከራ ተካሄዷል።ያለተገላቢጦሽ ግልባጭ የተገኘው PCR ምርት ከጂኖም የተገኘ ነው።