አጠቃላይ እይታ
ትራንስጀኒክ ተክሎችን በፍጥነት መለየት
ጽሑፍ/ቶንግ ዩቼንግ
የሙከራ ክዋኔ / ሃን ዪንግ
አርታዒ / Wen Youjun
ቃላት / 1600+
የሚመከር የንባብ ጊዜ/8-10 ደቂቃ
ትራንስጀኒክ ተክሎችን በፍጥነት መለየት
በቤተ ሙከራ ውስጥ አዲስ መጤ እንደመሆኖ፣ ዝቅተኛ የመቀየር ፍጥነት ካለው ከበርካታ ተክሎች ውስጥ አወንታዊ እፅዋትን ማጣራት ጥሩ ስራ አይደለም።በመጀመሪያ፣ ዲ ኤን ኤ ከብዙ ናሙናዎች አንድ በአንድ ማውጣት አለበት፣ ከዚያም የውጭ ጂኖች በ PCR ተገኝቷል።ይሁን እንጂ ውጤቶቹ ብዙውን ጊዜ ባዶዎች እና ጥቂት እቃዎች አልፎ አልፎ ነው, ነገር ግን ያመለጡ ማወቂያዎች ወይም የውሸት ማወቂያዎች መኖራቸውን ለመወሰን አይቻልም..እንዲህ ዓይነቱን የሙከራ ሂደት እና ውጤቶችን መጋፈጥ በጣም አቅመ ቢስ ነው?አይጨነቁ፣ ወንድም ትራንስጀኒክ አወንታዊ እፅዋትን በቀላሉ እና በትክክል እንዴት ማጣራት እንደሚችሉ ያስተምራል።
ደረጃ 1: የንድፍ ማወቂያ ፕሪመር
በሚመረመረው ናሙና መሰረት ሊገኙ የሚችሉትን ኢንዶጅን ጂን እና ውጫዊ ጂን ይወስኑ እና ለፕሪመር ዲዛይን በጂን ውስጥ ከ100-500ቢፒ ተከታታይ ተወካይ ይምረጡ።ጥሩ ፕሪመርሮች የፍተሻ ውጤቶቹን ትክክለኛነት ያረጋግጣሉ እና የፍተሻ ጊዜን ያሳጥራሉ (ብዙውን ጊዜ ጥቅም ላይ ለዋለ የፍተሻ ፕሪመር አባሪ ይመልከቱ)።
ማስታወሻ:
አዲስ የተነደፉት ፕሪመርሮች መጠነ ሰፊ ማወቂያን ከማድረጋቸው በፊት የምላሽ ሁኔታዎችን ማመቻቸት እና የማግኘቱን ትክክለኛነት፣ ትክክለኛነት እና የማወቅ ገደብ ማረጋገጥ አለባቸው።
ደረጃ 2፡የሙከራ ፕሮቶኮልን ያዘጋጁ
አዎንታዊ ቁጥጥር፡ የ PCR ምላሽ ሥርዓት እና ሁኔታዎች መደበኛ መሆናቸውን ለመወሰን የታለመውን ክፍልፋይ የያዘውን የተጣራውን ዲ ኤን ኤ እንደ አብነት ይጠቀሙ።
አሉታዊ/ባዶ መቆጣጠሪያ፡ የዲኤንኤ አብነት ወይም ddH ይጠቀሙ2በ PCR ሲስተም ውስጥ የብክለት ምንጭ መኖሩን ለማወቅ የታለመውን ክፍል እንደ አብነት ያልያዘ።
የውስጥ ማመሳከሪያ ቁጥጥር፡ አብነት በ PCR ሊታወቅ ይችል እንደሆነ ለመገምገም የናሙናውን የውስጥ ጂን ፕሪመር/ምርመራ ይጠቀሙ።
ማስታወሻ:
የሙከራ ውጤቱን ትክክለኛነት ለመገምገም አወንታዊ፣ አሉታዊ/ባዶ ቁጥጥሮች እና የውስጥ ቁጥጥር መቆጣጠሪያዎች ለእያንዳንዱ ፈተና መዘጋጀት አለባቸው።
ደረጃ 3፡ የሙከራ ዝግጅት
ከመጠቀምዎ በፊት, መፍትሄው በእኩል መጠን የተደባለቀ መሆኑን ይመልከቱ.ዝናብ ከተገኘ, ከመጠቀምዎ በፊት እንደ መመሪያው መሟሟት እና መቀላቀል ያስፈልጋል.2× PCR ድብልቅን ያልተስተካከለ የ ion ስርጭትን ለማስቀረት ከመጠቀምዎ በፊት በፓይፕ መጥረግ እና በተደጋጋሚ በማይክሮፒፔት መቀላቀል ያስፈልጋል።
ማስታወሻ:
መመሪያዎቹን አውጥተው በጥንቃቄ አንብባቸው, እና ከሙከራው በፊት በመመሪያው መሰረት ጥብቅ ዝግጅት ያድርጉ.
ደረጃ 4: PCR ምላሽ ሥርዓት ማዘጋጀት
በሙከራ ፕሮቶኮል መሰረት ፕሪምሮችን፣ ኤች2ኦ፣ 2× PCR ቅልቅል፣ ሴንትሪፉጅ እና ለእያንዳንዱ ምላሽ ቱቦ ያሰራጫቸው።
ማስታወሻ:
ለትላልቅ ወይም የረጅም ጊዜ ሙከራዎች የዩኤንጂ ኢንዛይም የያዘ የ PCR ምላሽ ስርዓት እንዲጠቀሙ ይመከራል ይህም በ PCR ምርቶች ምክንያት የሚከሰተውን የኤሮሶል ብክለትን በተሳካ ሁኔታ ያስወግዳል።
ደረጃ 5፡ የምላሽ አብነት ያክሉ
Direct PCR ቴክኖሎጂን በመጠቀም አሰልቺ የሆነ ኑክሊክ አሲድ የማጥራት ሂደት አያስፈልግም።የናሙና አብነት በ 10 ደቂቃዎች ውስጥ ተዘጋጅቶ ወደ ተጓዳኙ PCR ምላሽ ስርዓት መጨመር ይቻላል.
ማስታወሻ:
የሊሲስ ዘዴ የተሻለ የመለየት ውጤት አለው, እና የተገኘው ምርት ለብዙ የመለየት ምላሾች ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.
5.1: ቀጥተኛ PCR ቅጠሎች
በመመሪያው ውስጥ ባለው የምስሉ መጠን መሰረት ከ2-3 ሚሊ ሜትር የሆነ ዲያሜትር ያለው ቅጠል ቲሹ ይቁረጡ እና በ PCR ምላሽ ስርዓት ውስጥ ያስቀምጡት.
ማሳሰቢያ: የቅጠል ቁርጥራጮች ሙሉ በሙሉ በ PCR ምላሽ መፍትሄ ውስጥ መግባታቸውን ያረጋግጡ እና ከመጠን በላይ የቅጠል ቲሹን አይጨምሩ።
5.2: ቅጠል lysis ዘዴ
ከ5-7 ሚሊ ሜትር የሆነ ዲያሜትር ያለው ቅጠል ቲሹ ይቁረጡ እና በሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ ያስቀምጡት.የጎለመሱ ቅጠሎችን ከመረጡ, እባክዎን ዋናውን የቅጠሉ ደም መላሽ ቧንቧዎችን ከመጠቀም ይቆጠቡ.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ወደ ሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ ያስገባል, የሊዛው ቅጠልን ሙሉ በሙሉ ማጥለቅ, በሙቀት ዑደት ወይም በብረት መታጠቢያ ውስጥ ማስቀመጥ እና በ 95 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ለ 5-10 ደቂቃዎች ሊዝ.
50ul Buffer P2 ገለልተኛ መፍትሄን ይጨምሩ እና በደንብ ይቀላቅሉ።የተገኘው lysate እንደ አብነት ጥቅም ላይ ሊውል እና ወደ PCR ምላሽ ስርዓት መጨመር ይቻላል.
ማሳሰቢያ፡ የአብነት መጠኑ ከ5-10% PCR ስርዓት መሆን አለበት እና ከ20% መብለጥ የለበትም (ለምሳሌ በ20μl PCR ሲስተም 1-2μl የሊሲስ ቋት ከ4μl ያልበለጠ)።
ደረጃ 6፡ PCR ምላሽ
የ PCR ምላሽ ቱቦን ሴንትሪፉል ካደረጉ በኋላ፣ ለማጉላት በ PCR መሣሪያ ውስጥ ያስቀምጧቸው።
ማስታወሻ:
ምላሹ ለማጉላት ያልጸዳ አብነት ይጠቀማል፣ ስለዚህ የማጉላት ዑደቶች ቁጥር የተጣራ የዲኤንኤ አብነት ከመጠቀም ይልቅ 5-10 ተጨማሪ ዑደቶች ነው።
ደረጃ 7 የኤሌክትሮፊዮሬሲስ ግኝት እና የውጤት ትንተና
M፡100ቢፒ ዲኤንኤ መሰላል
1\4፡ የተጣራ የዲኤንኤ ዘዴ
2\5: ቀጥተኛ PCR ዘዴ
3\6፡ ባዶ ቁጥጥር
የጥራት ቁጥጥር:
በሙከራው ውስጥ የተቀመጡት የተለያዩ መቆጣጠሪያዎች የሙከራ ውጤቶች የሚከተሉትን ሁኔታዎች ማሟላት አለባቸው.አለበለዚያ የችግሩ መንስኤ መተንተን አለበት, እና ችግሩ ከተወገደ በኋላ ፈተናው እንደገና መከናወን አለበት.
ሠንጠረዥ 1. የተለያዩ የቁጥጥር ቡድኖች መደበኛ የፈተና ውጤቶች
*ፕላስሚድ እንደ አወንታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ሲውል፣ የጂን ምርመራ ውጤት አሉታዊ ሊሆን ይችላል።
የውጤት ፍርድ፡-
ሀ. የናሙናው ኢንዶጀንየስ ዘረ-መል (ጅን) የፈተና ውጤት አሉታዊ ነው፣ ይህም ለመደበኛ PCR ማወቂያ ተስማሚ የሆነው ዲኤንኤ ከናሙናው ሊወጣ እንደማይችል ወይም የተወሰደው ዲ ኤን ኤ የ PCR ምላሽ አጋቾችን እንደያዘ እና ዲ ኤን ኤው እንደገና መነሳት እንዳለበት ያሳያል።
ለ. የናሙና ኤንዶጅን ጂን የፈተና ውጤት አዎንታዊ ሲሆን የውጪው ዘረ-መል (ጅን) የፈተና ውጤት አሉታዊ ነው, ይህም ለመደበኛ PCR ማወቂያ ተስማሚ የሆነው ዲ ኤን ኤ ከናሙናው የወጣ ነው, እና የ XXX ጂን ናሙና ውስጥ አልተገኘም ብሎ ሊፈረድበት ይችላል.
ሐ. የናሙና ኤንዶጅን ጂን የፈተና ውጤት አወንታዊ ሲሆን የውጪው ዘረ-መል (ጅን) የፈተና ውጤት አዎንታዊ ነው፣ ይህም ለመደበኛ PCR ማወቂያ ተስማሚ የሆነው ዲ ኤን ኤ ከናሙናው ወጥቷል እና የናሙና ዲ ኤን ኤ XXX ጂን ይይዛል።የማረጋገጫ ሙከራዎች የበለጠ ሊከናወኑ ይችላሉ.
ደረጃ 8፡ የንድፍ ማወቂያ ፕሪመር
ከሙከራው በኋላ የአካባቢ ብክለትን ለመከላከል 2% የሶዲየም ሃይፖክሎራይት መፍትሄ እና 70% የኢታኖል መፍትሄን ይጠቀሙ።
አባሪ
ሠንጠረዥ 2. ለአጠቃላይ PCR በጄኔቲክ የተሻሻሉ እፅዋትን ለመለየት በብዛት ጥቅም ላይ የዋሉ ፕሪመርሮች
የማጣቀሻ ሰነድ፡-
SN/T 1202-2010፣ በምግብ ውስጥ በጄኔቲክ ለተሻሻሉ የእፅዋት ንጥረ ነገሮች ጥራት ያለው PCR የመፈለጊያ ዘዴ።
የግብርና ሚኒስቴር ማስታወቂያ 1485-5-2010፣ በዘረመል የተሻሻሉ እፅዋት ንጥረ ነገሮችን እና ምርቶቻቸውን - ሩዝ M12 እና ተዋጽኦዎቹን መሞከር።
የልጥፍ ሰዓት፡- ሰኔ-09-2021
