በላብራቶሪ ውስጥ እንደ አዲስ, ዝቅተኛ የመቀየሪያ መጠን ካለው የእጽዋት ስብስብ ውስጥ አወንታዊ እፅዋትን ለማጣራት ጥሩ ስራ አይደለም.በመጀመሪያ፣ ዲ ኤን ኤ ከብዙ ናሙናዎች አንድ በአንድ ማውጣት አለበት፣ ከዚያም የውጭ ጂኖች በ PCR ተገኝቷል።ይሁን እንጂ ውጤቶቹ ብዙውን ጊዜ ባዶዎች እና ጥቂት እቃዎች አልፎ አልፎ ነው, ነገር ግን ያመለጡ ማወቂያዎች ወይም የውሸት ማወቂያዎች መኖራቸውን ለመወሰን አይቻልም..እንዲህ ዓይነቱን የሙከራ ሂደት እና ውጤቶችን መጋፈጥ በጣም አቅመ ቢስ ነው?አይጨነቁ፣ ወንድም ትራንስጀኒክ አወንታዊ እፅዋትን በቀላሉ እና በትክክል እንዴት ማጣራት እንደሚችሉ ያስተምራል።

ደረጃ 1

የንድፍ ማወቂያ ፕሪመር

በሚመረመረው ናሙና መሰረት ሊገኙ የሚችሉትን ኢንዶጅን ጂን እና ውጫዊ ጂን ይወስኑ እና ለፕሪመር ዲዛይን በጂን ውስጥ ከ100-500ቢፒ ተከታታይ ተወካይ ይምረጡ።ጥሩ ፕሪመርሮች የፍተሻ ውጤቶቹን ትክክለኛነት ያረጋግጣሉ እና የፍተሻ ጊዜን ያሳጥራሉ (ብዙውን ጊዜ ጥቅም ላይ ለዋለ የፍተሻ ፕሪመር አባሪ ይመልከቱ)።

ማሳሰቢያ፡- አዲስ የተነደፉት ፕሪመርሮች መጠነ ሰፊ ከማግኘታቸው በፊት የምላሽ ሁኔታዎችን ማመቻቸት እና የማወቅን ትክክለኛነት፣ ትክክለኛነት እና የማወቅ ገደብ ማረጋገጥ አለባቸው።

ደረጃ 2

የሙከራ ፕሮቶኮል ንድፍ

አዎንታዊ ቁጥጥር፡ የ PCR ምላሽ ሥርዓት እና ሁኔታዎች መደበኛ መሆናቸውን ለመወሰን የታለመውን ክፍልፋይ የያዘውን የተጣራውን ዲ ኤን ኤ እንደ አብነት ይጠቀሙ።

አሉታዊ/ባዶ መቆጣጠሪያ፡ በ PCR ሲስተም ውስጥ የብክለት ምንጭ መኖሩን ለማወቅ የዒላማውን ክፍልፋይ የሌለውን የDNA አብነት ወይም ddH2O እንደ አብነት ይጠቀሙ።

የውስጥ ማመሳከሪያ ቁጥጥር፡ አብነት በ PCR ሊታወቅ ይችል እንደሆነ ለመገምገም የናሙናውን የውስጥ ጂን ፕሪመር/ምርመራ ይጠቀሙ።

ማሳሰቢያ፡-

የሙከራ ውጤቱን ትክክለኛነት ለመገምገም አወንታዊ፣ አሉታዊ/ባዶ ቁጥጥሮች እና የውስጥ ቁጥጥር መቆጣጠሪያዎች ለእያንዳንዱ ፈተና መዘጋጀት አለባቸው።

የሙከራ ዝግጅት

ከመጠቀምዎ በፊት, መፍትሄው በእኩል መጠን የተደባለቀ መሆኑን ይመልከቱ.ዝናብ ከተገኘ, ከመጠቀምዎ በፊት እንደ መመሪያው መሟሟት እና መቀላቀል ያስፈልጋል.2× PCR ድብልቅን ያልተስተካከለ የ ion ስርጭትን ለማስቀረት ከመጠቀምዎ በፊት በፓይፕ መጥረግ እና በተደጋጋሚ በማይክሮፒፔት መቀላቀል ያስፈልጋል።

ማሳሰቢያ፡-

መመሪያውን አውጥተው በጥንቃቄ ያንብቡት እና ከሙከራው በፊት በመመሪያው መስፈርቶች መሰረት ቅድመ ዝግጅቶችን ያድርጉ.

ደረጃ 4

PCR ምላሽ ሥርዓት ማዘጋጀት

በሙከራ ፕሮቶኮል መሰረት ፕሪምሮችን፣H2O እና 2×PCRን በእኩል መጠን በማደባለቅ ሴንትሪፉል በማድረግ ለእያንዳንዱ ምላሽ ቱቦ ያሰራጩ።

ማሳሰቢያ፡-

ለትላልቅ ወይም የረጅም ጊዜ ሙከራዎች የዩኤንጂ ኢንዛይም የያዘ የ PCR ምላሽ ስርዓት እንዲጠቀሙ ይመከራል ይህም በ PCR ምርቶች ምክንያት የሚከሰተውን የኤሮሶል ብክለትን በተሳካ ሁኔታ ያስወግዳል።

ደረጃ 5

የምላሽ አብነት ያክሉ

Direct PCR ቴክኖሎጂን በመጠቀም አሰልቺ የሆነ የኒውክሊክ አሲድ የማጥራት ሂደት አያስፈልግም, ናሙና አብነት በ 10 ደቂቃዎች ውስጥ ሊዘጋጅ ይችላል, እና ተዛማጅ PCR ምላሽ ስርዓት መጨመር ይቻላል.

ማሳሰቢያ፡-

የመክፈያ ዘዴው የተሻለ የመለየት ውጤት አለው, እና የተገኘው ምርት ለብዙ የመለየት ምላሾች ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.

5.1: ቅጠሎችን በቀጥታ ማስፋፋት

በመመሪያው ውስጥ ባለው የምስሉ መጠን መሰረት ከ2-3 ሚሊ ሜትር የሆነ ዲያሜትር ያለው ቅጠል ቲሹ ይቁረጡ እና በ PCR ምላሽ ስርዓት ውስጥ ያስቀምጡት.

ማሳሰቢያ: የቅጠል ቁርጥራጮች ሙሉ በሙሉ በ PCR ምላሽ መፍትሄ ውስጥ መግባታቸውን ያረጋግጡ እና ከመጠን በላይ የቅጠል ቲሹን አይጨምሩ።

5.2: ቅጠል መከፋፈል ዘዴ

ከ5-7 ​​ሚሊ ሜትር የሆነ ዲያሜትር ያለው ቅጠል ቲሹ ይቁረጡ እና በሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ ያስቀምጡት.የጎለመሱ ቅጠሎችን ከመረጡ, እባክዎን ዋናውን የቅጠሉ ደም መላሽ ቧንቧዎችን ከመጠቀም ይቆጠቡ.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ወደ ሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ ያስገባል, የሊዛው ቅጠልን ሙሉ በሙሉ ማጥለቅ, በሙቀት ዑደት ወይም በብረት መታጠቢያ ውስጥ ማስቀመጥ እና በ 95 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ለ 5-10 ደቂቃዎች ሊዝ.

50ul Buffer P2 ገለልተኛ መፍትሄን ይጨምሩ እና በደንብ ይቀላቅሉ።የተገኘው lysate እንደ አብነት ጥቅም ላይ ሊውል እና ወደ PCR ምላሽ ስርዓት መጨመር ይቻላል.

ማሳሰቢያ፡ የአብነት መጠኑ ከ5-10% PCR ስርዓት ነው እና ከ20% መብለጥ የለበትም (ለምሳሌ በ20μl PCR ስርዓት ከ1-2μl የሊሲስ መፍትሄ ከ4μl ያልበለጠ)።

ደረጃ 6

PCR ምላሽ

የ PCR ምላሽ ቱቦን ሴንትሪፉል ካደረጉ በኋላ፣ ለማጉላት በ PCR መሣሪያ ውስጥ ይቀመጣል።

ማሳሰቢያ፡-

ምላሹ ለማጉላት ያልጸዳ አብነት ይጠቀማል፣ ስለዚህ የማጉላት ዑደቶች ቁጥር የተጣራ የዲኤንኤ አብነት ከመጠቀም ይልቅ 5-10 ተጨማሪ ዑደቶች ነው።

ደረጃ 7

ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ማወቂያ እና የውጤት ትንተና

መ፡ 100ቢፒ ዲኤንኤ መሰላል

1\4፡ የተጣራ የዲኤንኤ ዘዴ

2\5: ቀጥተኛ PCR ዘዴ

3\6፡ ባዶ ቁጥጥር

QC፡

በሙከራው ውስጥ የተቀመጡት የተለያዩ መቆጣጠሪያዎች የፈተና ውጤቶች የሚከተሉትን ሁኔታዎች ማሟላት አለባቸው.አለበለዚያ የችግሩ መንስኤ መተንተን አለበት, እና ችግሩ ከተወገደ በኋላ ፈተናው እንደገና መከናወን አለበት.

ሠንጠረዥ 1. የተለያዩ የቁጥጥር ቡድኖች መደበኛ የፈተና ውጤቶች

*ፕላስሚድ እንደ አወንታዊ ቁጥጥር ጥቅም ላይ ሲውል፣ የጂን ምርመራ ውጤት አሉታዊ ሊሆን ይችላል።

የውጤት ፍርድ፡-

ሀ. የናሙናው ኢንዶጀንየስ ዘረ-መል (ጅን) የፈተና ውጤት አሉታዊ ነው፣ ይህም ለመደበኛ PCR ማወቂያ ተስማሚ የሆነው ዲኤንኤ ከናሙናው ሊወጣ እንደማይችል ወይም የተወሰደው ዲ ኤን ኤ የ PCR ምላሽ አጋቾችን እንደያዘ እና ዲ ኤን ኤው እንደገና መነሳት እንዳለበት ያሳያል።

ለ. የናሙና ኤንዶጅን ጂን የፈተና ውጤት አወንታዊ ሲሆን የውጪው ዘረ-መል (exogenous gene) የፈተናው ውጤት ኔጌቲቭ ነው ይህም ለመደበኛ PCR ማወቂያ ተስማሚ የሆነ ዲ ኤን ኤ ከናሙናው የወጣ መሆኑን እና የ XXX ጂን በናሙናው ውስጥ እንዳልተገኘ ሊፈረድበት ይችላል።

ሐ. የናሙና ኤንዶጅን ጂን የፈተና ውጤት አወንታዊ ሲሆን የውጪው ዘረ-መል (ጅን) የፈተና ውጤት አወንታዊ ነው ይህም ለመደበኛ PCR ማወቂያ ተስማሚ የሆነ ዲ ኤን ኤ ከናሙናው ወጥቷል እና ናሙናው ዲ ኤን ኤ ኤክስኤክስክስ ጂን ይዟል።የማረጋገጫ ሙከራዎች የበለጠ ሊከናወኑ ይችላሉ.

ደረጃ 8

የንድፍ ማወቂያ ፕሪመር

ከሙከራው በኋላ የአካባቢ ብክለትን ለመከላከል 2% የሶዲየም ሃይፖክሎራይት መፍትሄ እና 70% የኢታኖል መፍትሄ ይጠቀሙ።