RT-qPCR የተሰራው ከተራ PCR ቴክኖሎጂ ነው።የፍሎረሰንት ኬሚካሎችን (የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች ወይም የፍሎረሰንት መመርመሪያዎችን) ወደ ተለምዷዊ PCR ምላሽ ሥርዓት ይጨምረዋል፣ እና PCR የማጣራት እና የማራዘሚያ ሂደትን እንደየልዩ ብርሃን አሠራራቸው በእውነተኛ ጊዜ ይገነዘባል።በመካከለኛው ውስጥ ያሉ የፍሎረሰንት ምልክት ለውጦች በእያንዳንዱ የ PCR ዑደት ውስጥ ያለውን የምርት ለውጥ መጠን ለማስላት ያገለግላሉ።በአሁኑ ጊዜ በጣም የተለመዱት ዘዴዎች የፍሎረሰንት ማቅለሚያ ዘዴ እና የመመርመሪያ ዘዴ ናቸው.

የፍሎረሰንት ቀለም ዘዴ;
እንደ SYBR Green Ⅰ፣ PicoGreen፣ BEBO፣ ወዘተ ያሉ አንዳንድ የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች በራሳቸው ብርሃን አይሰጡም፣ ነገር ግን ከዲኤስዲኤን ትንሽ ግሩቭ ጋር ከተጣመሩ በኋላ ፍሎረሰንት ያወጣሉ።ስለዚህ, በ PCR ምላሽ መጀመሪያ ላይ ማሽኑ የፍሎረሰንት ምልክትን መለየት አይችልም.ምላሹ ወደ ማደንዘዣ-ማራዘሚያ (ባለሁለት-ደረጃ ዘዴ) ወይም የኤክስቴንሽን ደረጃ (የሶስት-ደረጃ ዘዴ) ሲሄድ ፣ በዚህ ጊዜ ድርብ ክሮች ይከፈታሉ ፣ እና አዲሱ የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ በ strand synthesis ጊዜ ፣ ​​የፍሎረሰንት ሞለኪውሎች በ dsDNA ጥቃቅን ግሩቭ ውስጥ ይጣመራሉ እና ፍሎረሰንት ያወጣሉ።የ PCR ዑደቶች ቁጥር እየጨመረ በሄደ ቁጥር ተጨማሪ ቀለሞች ከ dsDNA ጋር ይጣመራሉ, እና የፍሎረሰንት ምልክት እንዲሁ ያለማቋረጥ ይጨምራል.SYBR አረንጓዴ Ⅰን እንደ ምሳሌ እንውሰድ።
የምርመራ ዘዴ፡-
Taqman probe በብዛት ጥቅም ላይ የሚውለው የሃይድሮሊሲስ ምርመራ ነው።በምርመራው 5′ መጨረሻ ላይ የፍሎረሰንት ቡድን አለ፣ ብዙ ጊዜ FAM።ፍተሻው ራሱ ለታለመው ዘረ-መል (ጅን) ማሟያ ቅደም ተከተል ነው።በፍሎሮፎሬው 3′ ጫፍ ላይ የፍሎረሰንት ማጥፊያ ቡድን አለ።በፍሎረሰንት ሬዞናንስ ኢነርጂ ማስተላለፍ መርህ (Förster resonance energy transfer, FRET) መሰረት, ዘጋቢው የፍሎረሰንት ቡድን (ለጋሽ ፍሎረሰንት ሞለኪውል) እና የሚያጠፋው የፍሎረሰንት ቡድን (ተቀባይ ፍሎረሰንት ሞለኪውል) የ excitation spectrum ሲደራረብ እና ርቀቱ በጣም ቅርብ በሆነበት ጊዜ (7-10nm of the excitation of the excitation the excitation) የፍሎረሰንት ፍሎረሰንት ሞለኪውልን ሲቀበል ሞለኪውል, autofluorescence ሲዳከም.ስለዚህ, በ PCR ምላሽ መጀመሪያ ላይ, ፍተሻው ነፃ እና በሲስተሙ ውስጥ ያልተነካ, የሪፖርተር ፍሎረሰንት ቡድን ፍሎረሰንት አይፈጥርም.በሚሰርዙበት ጊዜ ፕሪመር እና መፈተሻ ከአብነት ጋር ይያያዛሉ።በማራዘሚያው ደረጃ, ፖሊሜሬዝ ያለማቋረጥ አዳዲስ ሰንሰለቶችን ያዘጋጃል.ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ 5′-3′ exonuclease እንቅስቃሴ አለው።ወደ ፍተሻው ሲደርሱ የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ መፈተሻውን ከአብነት ውስጥ በሃይድሮላይዝ ያደርገዋል፣ ዘጋቢውን የፍሎረሰንት ቡድን ከኩዌንቸር ፍሎረሰንት ቡድን ይለያል እና የፍሎረሰንት ምልክቱን ይለቃል።በመመርመሪያው እና በአብነት መካከል የአንድ ለአንድ ግንኙነት ስላለ፣ የፈተና ዘዴው ከሙከራው ትክክለኛነት እና ስሜታዊነት አንፃር ከቀለም ዘዴ የላቀ ነው።

ምስል 1 የqRT-PCR መርህ

የፕሪመር ንድፍ
መርሆዎች፡-

ፕሪመርዎቹ በተጠበቀው የኑክሊክ አሲድ ተከታታይ ክልል ውስጥ የተነደፉ እና ልዩነት ሊኖራቸው ይገባል.

የሲዲኤንኤ ቅደም ተከተል መጠቀም ጥሩ ነው, እና mRNA ቅደም ተከተል እንዲሁ ተቀባይነት አለው.ካልሆነ የዲኤንኤውን ቅደም ተከተል የሲዲዎች ክልል ንድፍ ይወቁ.
የፍሎረሰንት መጠናዊ ምርት ርዝመት 80-150bp, ረዥሙ 300bp ነው, የፕሪመር ርዝመት በአጠቃላይ በ17-25 መሠረቶች መካከል ነው, እና ከላይ እና ከታች ባለው ተፋሰስ መካከል ያለው ልዩነት በጣም ትልቅ መሆን የለበትም.

የG+C ይዘት ከ40% እስከ 60% ነው፣ እና 45-55% ምርጥ ነው።
የቲኤም ዋጋ በ58-62 ዲግሪዎች መካከል ነው።
የፕራይመር ዲመሮችን እና የራስ-ዲሜሮችን ለማስወገድ ይሞክሩ, (ከ 4 ጥንድ ተከታታይ ማሟያ መሠረቶች በላይ አይታዩም) የፀጉር አሠራር, የማይቀር ከሆነ, ΔG ያድርጉ<4.5kJ/mol* በግልባጭ ግልባጭ ወቅት gDNA መወገዱን ማረጋገጥ ካልቻላችሁ ንጹህ የመግቢያውን ፕሪመር ዲዛይን ማድረግ የተሻለ ነው, AT ሊስተካከል አይችልም, ጂ አይቀየርም, ጂ አይስተካከልም * 3′ ጂ መራቅ ይችላል. ቀጣይነት ያለው መዋቅር (2-3) ፕሪመር እና ያልሆኑ
የተወሰነ የሄትሮጂን አምፕሊፋይድ ቅደም ተከተል ግብረ-ሰዶማዊነት ከ 70% ያነሰ ይመረጣል ወይም 8 ተጨማሪ ቤዝ ሆሞሎጂ አለው.
የውሂብ ጎታ፡
የጥጥ ኤፍጂዲ ፍለጋ በቁልፍ ቃላት
የመጀመሪያ ደረጃ ንድፍ;
IDT-qPCR ፕሪመር ንድፍ

Fig2 IDT የመስመር ላይ የፕሪመር ንድፍ መሣሪያ ገጽ

ምስል 3 የውጤት ገጽ ማሳያ
የ lncRNA primers ንድፍ;
lncRNAእንደ mRNA ተመሳሳይ እርምጃዎች.
ሚአርኤንየስቴም-ሉፕ ዘዴ መርህ፡- ሁሉም ሚአርኤንኤዎች ወደ 23 nt ያህል አጫጭር ቅደም ተከተሎች በመሆናቸው ቀጥተኛ PCR ፈልጎ ማግኘት አይቻልም፣ ስለዚህ የስቲም-ሉፕ ቅደም ተከተል መሳሪያ ጥቅም ላይ ይውላል።የስቴም-ሉፕ ቅደም ተከተል 50 nt ያህል የሆነ ባለ አንድ ገመድ ዲ ኤን ኤ ነው, እሱም በራሱ የፀጉር አሠራር ሊፈጥር ይችላል.3 'መጨረሻው ከሚሚአርአን ከፊል ቁርጥራጭ ጋር እንደ ቅደም ተከተል ማሟያ ሆኖ ሊቀረጽ ይችላል፣ከዚያም ኢላማው ሚአርኤን ከግንድ-ሉፕ ቅደም ተከተል ጋር በግልባጭ ግልባጭ ሊገናኝ ይችላል፣እና አጠቃላይ ርዝመቱ 70bp ሊደርስ ይችላል፣ይህም በqPCR ከተወሰነው የተጨመረው ምርት ርዝመት ጋር የሚስማማ ነው።የጅራት ማይአርኤን ፕሪመር ንድፍ .
ማጉላት-ተኮር ማወቂያ፡
የመስመር ላይ ፍንዳታ ዳታቤዝ፡ የጥጥ ኤፍጂዲ ፍንዳታ በቅደም ተከተል ተመሳሳይነት
የአካባቢ ፍንዳታ፡- የአካባቢ ፍንዳታ ለማድረግ Blast+ መጠቀምን ይመልከቱ፣ ሊኑክስ እና ማኮስ የአካባቢያዊ ዳታቤዝ በቀጥታ መመስረት ይችላሉ፣ win10 ሲስተምም ubuntu bash ከጫኑ በኋላ ሊከናወን ይችላል።የአካባቢ ፍንዳታ የውሂብ ጎታ እና የአካባቢ ፍንዳታ ይፍጠሩ;ubuntu bash on win10 ን ይክፈቱ።
ማሳሰቢያ፡- የተራራ ጥጥ እና የባህር ደሴት ጥጥ የቴትራፕሎይድ ሰብሎች ናቸው፣ ስለዚህ የፍንዳታው ውጤት ብዙ ጊዜ ሁለት ወይም ከዚያ በላይ ግጥሚያዎች ይሆናል።ቀደም ሲል NAU ሲዲዎችን እንደ ዳታቤዝ በመጠቀም ፍንዳታን ለማስፈፀም ጥቂት የ SNP ልዩነቶች ያላቸው ሁለት ተመሳሳይነት ያላቸው ጂኖች ማግኘት ይቻላል.ብዙውን ጊዜ ሁለቱ ተመሳሳይነት ያላቸው ጂኖች በፕሪመር ዲዛይን ሊለያዩ አይችሉም, ስለዚህ እንደ አንድ አይነት ይያዛሉ.ግልጽ የሆነ ኢንዴል ካለ, ፕሪመር (ፕሪመር) ብዙውን ጊዜ የተነደፈው በንጣፉ ላይ ነው, ነገር ግን ይህ ወደ ፕሪመር ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ሊያመራ ይችላል የነፃ ኃይል ከፍ ያለ ይሆናል, ይህም የማጉላት ቅልጥፍናን ይቀንሳል, ነገር ግን ይህ የማይቀር ነው.

የአንደኛ ደረጃ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅርን መለየት;
እርምጃዎች፡-ክፍት oligo 7 → የግቤት አብነት ቅደም ተከተል → ንዑስ መስኮትን ይዝጉ → ያስቀምጡ → አብነት ላይ ፕሪመር ያግኙ ፣ የፕሪመር ርዝመትን ለማዘጋጀት ctrl + D ን ይጫኑ → የተለያዩ ሁለተኛ ደረጃ አወቃቀሮችን ይተንትኑ ፣ ለምሳሌ የራስ-ዲሜራይዜሽን አካል ፣ heterodimer ፣ hairpin ፣ mismatch ፣ ወዘተ በስእል 4 ላይ ያሉት የመጨረሻዎቹ ሁለት ሥዕሎች የፕሪምተሮች የፈተና ውጤቶች ናቸው።የፊት ፕሪመር ውጤቱ ጥሩ ነው, ምንም ግልጽ የሆነ ዲመር እና የፀጉር አሠራር የለም, ቀጣይነት ያለው ተጨማሪ መሠረት የለም, እና የነፃ ኃይል ፍፁም ዋጋ ከ 4.5 ያነሰ ነው, የኋላ ፕሪመር ግን ቀጣይነት ያለው ያሳያል 6 መሠረቶች ተጨማሪ ናቸው, እና ነፃው ኃይል 8.8 ነው.በተጨማሪም ፣ በ 3′ መጨረሻ ላይ የበለጠ ከባድ ዲመር ይታያል ፣ እና የ 4 ተከታታይ መሠረቶች ዳይመር ይታያል።ምንም እንኳን የነጻው ሃይል ከፍተኛ ባይሆንም፣ የ3′ ዲመር ቸል የማጉላት ስፔሲፊኬሽን እና የማጉላት ቅልጥፍናን በእጅጉ ሊጎዳ ይችላል።በተጨማሪም የፀጉር መርገጫዎችን, ሄትሮዲመሮችን እና አለመመጣጠን መኖሩን ማረጋገጥ አስፈላጊ ነው.

Fig3 oligo7 ማወቂያ ውጤቶች
የማጉላት ቅልጥፍናን መለየት፡-
የ PCR ምላሽ የማጉላት ውጤታማነት PCR ውጤቶችን በእጅጉ ይጎዳል።እንዲሁም በqRT-PCR ውስጥ፣ የማጉላት ብቃቱ በተለይ ለቁጥር ውጤቶች አስፈላጊ ነው።በምላሽ ቋት ውስጥ ሌሎች ንጥረ ነገሮችን፣ ማሽኖችን እና ፕሮቶኮሎችን ያስወግዱ።የፕሪመርሮች ጥራት በqRT-PCR የማጉላት ብቃት ላይም ትልቅ ተጽእኖ አለው።የውጤቶቹን ትክክለኛነት ለማረጋገጥ, ሁለቱም አንጻራዊ የፍሎረሰንት መጠን እና ፍፁም የፍሎረሰንት መጠን የፕሪሚየር ማጉላትን ውጤታማነት መለየት አለባቸው.ውጤታማ የqRT-PCR ማጉላት ቅልጥፍና በ85% እና 115% መካከል እንዳለ ይታወቃል።ሁለት ዘዴዎች አሉ:
1. መደበኛ ከርቭ ዘዴ፡-
ሀ.ሲዲ ኤን ኤ ይቀላቅሉ
ለ.ቀስ በቀስ ማቅለሚያ
c.qPCR
መ.የማጉላት ቅልጥፍናን ለማስላት መስመራዊ ሪግሬሽን እኩልታ
2. LinRegPCR
LinRegPCR በ SYBR አረንጓዴ ወይም ተመሳሳይ ኬሚስትሪ ላይ የተመሰረተ የቁጥር PCR (qPCR) መረጃ የእውነተኛ ጊዜ የ RT-PCR ውሂብ ትንተና ፕሮግራም ነው።መርሃግብሩ መሰረታዊ ያልሆነ የተስተካከለ መረጃን ይጠቀማል ፣ በእያንዳንዱ ናሙና ላይ የመነሻ እርማትን በተናጠል ያካሂዳል ፣ የመስመራዊ መስኮትን ይወስናል እና ከዚያ በ PCR የውሂብ ስብስብ በኩል ቀጥተኛ መስመርን ለመገጣጠም መስመራዊ ሪግሬሽን ትንተና ይጠቀማል።ከዚህ መስመር ቁልቁል የእያንዳንዱ ግለሰብ ናሙና PCR ውጤታማነት ይሰላል.አማካይ PCR ብቃት በአንድ amplicon እና የሲቲ እሴት በአንድ ናሙና በዘፈቀደ የፍሎረሰንስ ክፍሎች ውስጥ የተገለጸውን የመነሻ ትኩረት በአንድ ናሙና ለማስላት ያገለግላሉ።የውሂብ ግቤት እና ውፅዓት በ Excel ተመን ሉህ በኩል ናቸው።ናሙና ብቻ
ቅልቅል ያስፈልጋል, ምንም ቅልመት የለም
እርምጃዎች ያስፈልጋሉ:(ቦሌ CFX96ን እንደ ምሳሌ ውሰድ እንጂ ሙሉ በሙሉ ግልጽ የሆነ ኤቢአይ ያለው ማሽን አይደለም)
ሙከራ፡-እሱ መደበኛ የqPCR ሙከራ ነው።
qPCR ውሂብ ውፅዓት፡-LinRegPCR ሁለት የውጤት ፋይሎችን ሊያውቅ ይችላል፡ RDML ወይም Quantification Amplification ውጤት።እንደ እውነቱ ከሆነ, በማሽኑ የዑደት ቁጥር እና የፍሎረሰንስ ምልክት የእውነተኛ ጊዜ ማወቂያ ዋጋ ነው, እና ማጉያው የሚገኘው የመስመራዊ ክፍል ቅልጥፍናን የፍሎረሰንት ለውጥ ዋጋን በመተንተን ነው.
የውሂብ ምርጫበንድፈ ሀሳብ፣ የ RDML እሴት ጥቅም ላይ የሚውል መሆን አለበት።የኮምፒውተሬ ችግር ሶፍትዌሩ RDML መለየት አለመቻሉ ነው ተብሎ ይገመታል፣ስለዚህ የ Excel የውጤት ዋጋ እንደ ዋናው ዳታ አለኝ።እንደ ናሙናዎች መጨመር አለመሳካት, ወዘተ ያሉ ነጥቦቹ በውጤት ውሂቡ ውስጥ ሊሰረዙ ይችላሉ (በእርግጥ እነሱን መሰረዝ አይችሉም, LinRegPCR እነዚህን ነጥቦች በኋለኛው ደረጃ ችላ ይላቸዋል) በመጀመሪያ መረጃን ግምታዊ የማጣሪያ ምርመራ እንዲያካሂዱ ይመከራል.

Fig5 QPCR ውሂብ ወደ ውጭ መላክ

ምስል6 የእጩ ናሙናዎች ምርጫ

የውሂብ ግቤት፡የብቃት ማጉላት ውጤቶችን ክፈት.xls፣ → ክፈት LinRegPCR → ፋይል → ከ Excel ማንበብ → በስእል 7 ላይ እንደሚታየው መለኪያዎችን ምረጥ

የlinRegPCR ውሂብ ግቤት ምስል7 ደረጃዎች

ውጤት፡መደጋገም ከሌለ መቧደን አያስፈልግም።መደጋገም ካለ, ቡድኑን በናሙና ቡድን ውስጥ ማረም ይቻላል, እና የጂን ስም በመለያው ውስጥ ገብቷል, ከዚያም ተመሳሳይ ጂን በራስ-ሰር ይመደባል.በመጨረሻም ፋይሉን ጠቅ ያድርጉ፣ Excel ወደ ውጪ መላክ እና ውጤቱን ይመልከቱ።የእያንዳንዱ ጉድጓድ የማጉላት ብቃት እና R2 ውጤቶች ይታያሉ።በሁለተኛ ደረጃ፣ በቡድን ከተከፋፈሉ፣ የተስተካከለው አማካኝ የማጉላት ብቃት ይታያል።የእያንዳንዱ ፕሪመር የማጉላት ብቃት ከ85% እስከ 115% መሆኑን ያረጋግጡ።በጣም ትልቅ ወይም በጣም ትንሽ ከሆነ, የፕሪሚየር ማጉላት ውጤታማነት ደካማ ነው ማለት ነው.

ምስል 8 ውጤት እና የውሂብ ውፅዓት

የሙከራ ሂደት;
የአር ኤን ኤ ጥራት መስፈርቶች
ንጽህና፡1.72.0 ቀሪ isothiocyanate ሊኖር እንደሚችል ያሳያል።ንጹህ ኑክሊክ አሲድ A260/A230 ወደ 2 አካባቢ መሆን አለበት።በተጨማሪም, በ 1.5% agarose gel electrophoresis ሊታወቅ ይችላል.ምልክት ማድረጊያውን ያመልክቱ፣ ምክንያቱም ኤስኤስኤንኤ ዲናቱሬሽን ስለሌለው እና የሞለኪውላዊ ክብደት ሎጋሪዝም ቀጥተኛ ግንኙነት ስለሌለው እና የሞለኪውላው ክብደት በትክክል ሊገለጽ አይችልም።ማጎሪያ፡ በንድፈ ሀሳብአይደለምከ 100ng / ul ያነሰ, ትኩረቱ በጣም ዝቅተኛ ከሆነ, ንፅህናው በአጠቃላይ ዝቅተኛ አይደለም ረጅም ነው

ምስል9 አር ኤን ኤ ጄል

በተጨማሪም ናሙናው ውድ ከሆነ እና የአር ኤን ኤ ትኩረቱ ከፍ ያለ ከሆነ ከተጣራ በኋላ አር ኤን ኤውን ወደ 100-300ng/ul የመጨረሻ ትኩረት በመቀባት በተቃራኒው ቅጂ እንዲገለበጥ ይመከራል።ውስጥየተገላቢጦሽ ጽሑፍ ሂደትኤምአርኤን ሲገለበጥ፣ ኦሊጎ (ዲቲ) ፕሪመር በተለይ ከፖሊኤ ጅራት ጋር ሊጣበቁ የሚችሉ ፕሪመርሮች በተቃራኒው ለመገልበጥ ጥቅም ላይ ይውላሉ፣ lncRNA እና circRNA በዘፈቀደ ሄክሳመር (ራንደም 6 ሜር) አጠቃላይ አር ኤን ለመገልበጥ ፕሪመር ለሚር ኤን ኤ፣ ሚአርኤን ልዩ የሆነ አንገተ-ሉፕ ፕሪምየርስ ወደ ኋላ ለመገልበጥ ጥቅም ላይ ይውላሉ።ብዙ ኩባንያዎች አሁን ልዩ የጅራት ስብስቦችን ጀምረዋል.ለግንድ-ሉፕ ዘዴ፣ የጅራት ዘዴ የበለጠ ምቹ፣ ከፍተኛ መጠን ያለው እና ሬጀንት - ቁጠባ ነው፣ ነገር ግን የአንድ ቤተሰብ ማይአርኤን የመለየት ውጤት እንደ ግንድ-loop ዘዴ ጥሩ መሆን የለበትም።እያንዳንዱ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ኪት ለጂን-ተኮር ፕሪመር (ግንድ-ሉፕስ) ትኩረት መስፈርቶች አሉት።ለ miRNA ጥቅም ላይ የዋለው ውስጣዊ ማመሳከሪያ U6 ነው.ከግንድ-ሉፕ ተገላቢጦሽ ሂደት ውስጥ የ U6 ቱቦ በተናጠል መገልበጥ አለበት, እና የ U6 የፊት እና የኋላ ፕሪሚኖች በቀጥታ መጨመር አለባቸው.ሁለቱም cirRNA እና lncRNA HKGsን እንደ ውስጣዊ ማጣቀሻ ሊጠቀሙ ይችላሉ።ውስጥሲዲኤንኤ መለየት፣
በአር ኤን ኤ ላይ ምንም ችግር ከሌለ ሲዲኤንኤ እንዲሁ ጥሩ መሆን አለበት።ነገር ግን፣ የሙከራው ፍፁምነት ከተከተለ ጂዲኤንኤን ከሲዲዎች መለየት የሚችል የውስጥ ማጣቀሻ ጂን (ማጣቀሻ ጂን፣ RG) መጠቀም ጥሩ ነው።በአጠቃላይ፣ RG የቤት አያያዝ ጂን ነው።, HKG) በስእል 10 እንደሚታየው;በዚያን ጊዜ፣ የአኩሪ አተር ማከማቻ ፕሮቲን እሰራ ነበር፣ እና ለውስጣዊ ማመሳከሪያነት ኢንትሮኖችን የያዘ actin7 እጠቀም ነበር።በጂዲኤንኤ ውስጥ ያለው የተጨመረው የዚህ ፕሪመር ቁራጭ መጠን 452bp ነበር፣ እና ሲዲኤንኤ እንደ አብነት ጥቅም ላይ ከዋለ 142ቢቢ ነበር።ከዚያም የፈተና ውጤቶቹ የሲዲኤንኤው ክፍል በጂዲኤንኤ መበከሉን አረጋግጧል፣ እና በተገላቢጦሽ ግልባጭ ውጤት ላይ ምንም ችግር እንደሌለው አረጋግጧል እና ለ PCR እንደ አብነት ሊያገለግል ይችላል።የ agarose gel electrophoresis ን በቀጥታ ከሲዲኤንኤ ጋር ማስኬድ ምንም ፋይዳ የለውም፣ እና እሱ አሳማኝ ያልሆነ የተበታተነ ባንድ ነው።

ምስል 10 ሲዲኤንኤ ማግኘት

የqPCR ሁኔታዎችን መወሰንበአጠቃላይ በኬቲቱ ፕሮቶኮል መሰረት ምንም ችግር የለበትም, በዋናነት በቲኤም እሴት ደረጃ.አንዳንድ ፕሪመርሮች በፕሪመር ዲዛይን ጊዜ በደንብ ካልተነደፉ በቲኤም እሴት እና በቲዎሬቲካል 60 ዲግሪ ሴንቲግሬድ መካከል ትልቅ ልዩነት ሲፈጠር ሲዲኤንኤ ናሙናዎቹ ከተደባለቁ በኋላ የግራዲየንት PCRን በፕሪመር እንዲያካሂዱ ይመከራል እና የሙቀት መጠኑን ያለ ባንዶች እንደ ቲኤም እሴት ከማስቀመጥ ይቆጠቡ።

የውሂብ ትንተና

የተለመደው አንጻራዊ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ማቀነባበሪያ ዘዴ በመሠረቱ በ 2 መሠረት ነው-ΔΔCT.የውሂብ ሂደት አብነት.

ተዛማጅ ምርቶች፡

እውነተኛ ጊዜ PCR ቀላል^TM - ታቅማን

እውነተኛ ጊዜ PCR ቀላል^TM - SYBR GREEN I

RT Easy I (ማስተር ፕሪሚክስ ለመጀመሪያው ሲዲኤንኤ ውህደት)

RT Easy II(ማስተር ፕሪሚክስ ለመጀመሪያው ሲዲኤንኤ ውህደት ለqPCR)