ኮቪድ-19 በከባድ አጣዳፊ የመተንፈሻ አካላት ሲንድሮም የኮሮና ቫይረስ ዓይነት 2 የሚመጣ ተላላፊ በሽታ ነው። አንድ ሰው ሲታመም በጣም የተለመዱት ምልክቶች ትኩሳት፣ ሳል እና የትንፋሽ ማጠር ናቸው።

ለሙከራ ጥቅም ላይ የሚውሉት ናሙናዎች በ nasopharyngeal swabs ወይም oropharyngeal swabs ሊሰበሰቡ ይችላሉ.

PCR ምንድን ነው?

መደበኛው የኮሮና ቫይረስ መመርመሪያ ዘዴ ፖሊሜሬዝ ሰንሰለት ምላሽ፣ PCR ነው።ይህ በሞለኪውላር ባዮሎጂ ውስጥ በሰፊው ጥቅም ላይ የዋለ ዘዴ ነው.በሚሊዮን ወደ ቢሊዮኖች የሚቆጠሩ የተወሰኑ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን በፍጥነት መቅዳት ይችላል።

አዲሱ ኮሮናቫይረስ በጣም ረጅም ባለ አንድ ገመድ ያለው አር ኤን ኤ ጂኖም ይዟል።እነዚህን ቫይረሶች በፒሲአር ለመለየት የአር ኤን ኤ ሞለኪውሎች በተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴስ ወደ ተሟጋች የዲ ኤን ኤ ተከታታዮቻቸው መቀየር አለባቸው ከዚያም አዲስ የተቀናጀውን ዲ ኤን ኤ በመደበኛ ፒሲአር አሰራር ማለትም በተለምዶ RT-PCR በመባል ይታወቃል።

የ RT-PCR ሂደት

አር ኤን ኤ ማውጣት

ይህንን ዘዴ ለማከናወን, የቫይረስ አር ኤን ኤ በመሠረቱ መነሳት አለበት.የተለያዩ የአር ኤን ኤ ማጽጃ ኪት ምቹ፣ ፈጣን እና ውጤታማ መለያየትን መጠቀም ይቻላል።

የንግድ ኪት በመጠቀም የቫይረስ አር ኤን ኤ ለማውጣት በመጀመሪያ ናሙናውን ወደ ማይክሮ ሴንትሪፉጅ ቱቦ ይጨምሩ እና ከዚያ ከሊሲስ ቋት ጋር ያዋህዱት።ይህ ቋት በጣም የተወገደ ነው እና አብዛኛውን ጊዜ ፌኖል እና ጓኒዲን ኢሶቲኦሲያኔትን ያካትታል።በተጨማሪም ፣ ያልተነካ የቫይረስ አር ኤን ኤ መነጠልን ለማረጋገጥ RNase inhibitors ብዙውን ጊዜ በሊሲስ ቋት ውስጥ ይገኛሉ።

የሊሲስ ማቋቋሚያውን ከጨመሩ በኋላ የመቀላቀያ ቱቦውን በ pulse አዙረው በክፍል ሙቀት ውስጥ ይጨምሩ።ከዚያም ቫይረሱ በሊሲስ ቋት በሚሰጠው ከፍተኛ የጥላቻ ሁኔታዎች ውስጥ ይረጫል።

ናሙናው ከተጣራ በኋላ, ለንፅህናው ሂደት የሴንትሪፉጅ ቱቦ ጥቅም ላይ ይውላል.ናሙናው ወደ ሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ ይጫናል እና ከዚያም በሴንትሪፉል.

ይህ ሂደት የማይንቀሳቀስ ደረጃ የሲሊካ ጄል ማትሪክስ ያካተተ ጠንካራ ደረጃ የማውጣት ዘዴ ነው።

በጥሩ የጨው እና የፒኤች ሁኔታዎች ውስጥ የአር ኤን ኤ ሞለኪውሎች ከሲሊካ ሽፋን ጋር ይጣመራሉ።

በተመሳሳይ ጊዜ ፕሮቲን እና ሌሎች ብከላዎች ይወገዳሉ.

ከሴንትሪፉግ በኋላ የሴንትሪፉጅ ቱቦን ወደ ንጹህ የመሰብሰቢያ ቱቦ ውስጥ ያስቀምጡት, ማጣሪያውን ያስወግዱ እና ከዚያም ማጠቢያ ቋት ይጨምሩ.

የማጠቢያ ቋቱን በሽፋኑ ውስጥ ለማስገደድ እንደገና ቱቦውን በሴንትሪፉጅ ውስጥ ያስቀምጡት።ይህ ሁሉንም የተረፈውን ቆሻሻዎች ከሽፋን ያስወግዳል, አር ኤን ኤ ብቻ ከሲሊካ ጄል ጋር ይጣበቃል.

ናሙናው ከታጠበ በኋላ ቱቦውን ወደ ንፁህ ማይክሮ ሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ ማስገባት እና የኤሌክትሮማግኔቲክ ቋት መጨመር.

ከዚያም የኤሌክትሮማግኔቲክ ቋቱን በገለባው በኩል ለማስገደድ ማዕከላዊ ይደረጋል.የኤሌክትሮማግኔቲክ ቋት የቫይራል አር ኤን ኤ ከአከርካሪው አምድ ውስጥ ያስወግዳል እና ከፕሮቲን ፣ አጋቾች እና ሌሎች ተላላፊዎች ነፃ የሆነ የተጣራ አር ኤን ኤ ያገኛል።

ደረጃ 2

የተቀላቀለ ትኩረት

የቫይራል አር ኤን ኤውን ካወጣ በኋላ, ቀጣዩ እርምጃ ለ PCR ማጉላት የምላሽ ቅልቅል ማዘጋጀት ነው.በዚህ ደረጃ, ማጎሪያ ጥቅም ላይ ይውላል.ይህ የተጠናከረ መፍትሄ ፕሪሚክስ፣ ተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴስ፣ ኑክሊዮታይድ፣ ወደፊት ፕሪመር፣ ተገላቢጦሽ ፕሪመር፣ ታክማን መጠይቅ እና የዲኤንኤ ፖሊመሬሴን ያቀፈ የተቀናጀ የተጠናከረ መፍትሄ ነው።

በመጨረሻም, ይህንን የምላሽ ድብልቅ ለማጠናቀቅ, የአር ኤን ኤ አብነት ተጨምሯል.ቧንቧዎቹ በ pulse vortexing ይቀላቀላሉ, ከዚያም የምላሽ ድብልቅ በ PCR ሳህን ውስጥ ይጫናል.የ PCR ፕላስቲን አብዛኛውን ጊዜ 96 ጉድጓዶችን ይይዛል እና ብዙ ናሙናዎችን በአንድ ጊዜ መተንተን ይችላል.

ደረጃ 3

PCR ማጉላት

በመቀጠል ጠፍጣፋውን በ PCR ማሽን ውስጥ ያስቀምጡት, እሱም በመሠረቱ የሙቀት ዑደት ነው.

ሪል-ታይም RT-PCR በ RdrRP ጂን፣ ኢ ጂን እና ኤን ጂን ውስጥ የታለመውን ቅደም ተከተል በማጉላት የ2019 ልብ ወለድ ኮሮናቫይረስን ለመለየት ይጠቅማል።የታለመው ጂን ምርጫ በፕሪመር እና በምርመራ ቅደም ተከተል ላይ የተመሰረተ ነው.

የ RT-PCR የመጀመሪያው እርምጃ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ነው።የመጀመሪያው የማሟያ ዲ ኤን ኤ የተሰራ ሲሆን ይህም በ PCR reverse primer የተጀመረ ሲሆን ይህም ከቫይራል አር ኤን ኤ ጂኖም ተጨማሪ ክፍል ጋር ይጣመራል።ከዚያም የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴዝ የዲ ኤን ኤ ኑክሊዮታይድን በፕሪመር 3′ መጨረሻ ላይ በመጨመር ከቫይራል አር ኤን ኤ ጋር ተጨማሪውን ዲኤንኤ እንዲዋሃድ ያደርጋል።የዚህ እርምጃ የሙቀት መጠን እና የቆይታ ጊዜ የሚወሰነው በተጠቀመባቸው ፕሪመርሮች፣ ዒላማ አር ኤን ኤ እና በግልባጭ ትራንስክሪፕት ነው።

በመቀጠልም የመነሻ የዴንገት ደረጃ ተተግብሯል, ይህም የአር ኤን ኤ-ዲ ኤን ኤ ዲቃላ መበላሸትን ያስከትላል.ይህ እርምጃ የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬዜን ለማንቃት አስፈላጊ ነው.በተመሳሳይ ጊዜ, የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ ገቢር ሆኗል.

PCR ተከታታይ የሙቀት ዑደቶችን ያካትታል.እያንዳንዱ ዑደት denaturation, annealing እና ቅጥያ ደረጃዎች ያካትታል.

የ denaturation እርምጃ የምላሽ ክፍሉን ወደ 95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ማሞቅ እና ድርብ-ሽቦ ያለው የዲ ኤን ኤ አብነት ዲናቱሽን መጠቀምን ያካትታል።

በሚቀጥለው ደረጃ፣ የምላሽ ሙቀት ወደ 58 ዲግሪ ሴልሺየስ ይቀንሳል፣ ይህም የፊት ፕሪመር ነጠላ-ገመድ ያለው የዲ ኤን ኤ አብነት ተጓዳኝ ክፍልን እንዲሰርዝ ያስችለዋል።የማስታገሻው የሙቀት መጠን በቀጥታ በፕሪመር ርዝመት እና ቅንብር ላይ የተመሰረተ ነው.

በማራዘሚያው ደረጃ፣ ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ከዲኤንኤ አብነት ፈትል ጋር የሚደጋገፍ አዲስ የዲኤንኤ ፈትል ያዋህዳል።ከአጸፋው ድብልቅ በ 5'to 3'አቅጣጫ ወደ አብነት ነፃ የሆኑ ኒውክላይዎችን በማከል።የዚህ ደረጃ የሙቀት መጠን የሚወሰነው በዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ላይ ነው.

ከመጀመሪያው ዑደት በኋላ, ባለ ሁለት መስመር የዲ ኤን ኤ ዒላማ ተገኝቷል.

ከዚያም ሁለተኛውን ዑደት አስገባ.ባለ ሁለት ፈትል ዲ ኤን ኤ ሁለት ባለ ነጠላ የዲ ኤን ኤ ሞለኪውሎችን ለማምረት ተከልክሏል።

በሚቀጥለው ደረጃ፣ የምላሽ ሙቀት መጠን ይቀንሳል፣ ፕሪመርሮቹ ወደ እያንዳንዱ ነጠላ-ሽቦ ያለው የዲ ኤን ኤ አብነት ይጠቀለላሉ፣ እና የTaq-man መጠይቅ ወደ ኢላማው ዲኤንኤ ተጨማሪ ክፍል ይደመሰሳል።

የTaqMan ፍተሻ ከኦሊጎኑክሊዮታይድ መጠይቅ 5 ጫፍ ጋር የተገናኘ ፍሎሮፎርን ያካትታል።በሳይክልተሩ የብርሃን ምንጭ ሲደሰቱ ፍሎሮፎሬው ፍሎረሰንት ያመነጫል።በተጨማሪም, መመርመሪያው በ 3 ኛው ጫፍ ላይ በ quencher የተዋቀረ ነው.የሪፖርተሩ ጂን ወደ ኩንቸር ቅርበት ያለው የፍሎረሰንት መለየትን ይከላከላል.

በማራዘሚያው ደረጃ, የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ አዲስ ክር ያዋህዳል.ፖሊመሬሴው ወደ TaqMan መፈተሻ ሲደርስ፣ ውስጣዊው የ 5′ ኑክሊዮስ እንቅስቃሴው መፈተሻውን ይሰንጣል፣ ቀለሙን ከኩኪው ይለያል።

በእያንዳንዱ የ PCR ዑደት ብዙ ቀለም ያላቸው ሞለኪውሎች ይለቀቃሉ, በዚህም ምክንያት ከተዋሃዱ አምፖሎች ብዛት ጋር ተመጣጣኝ የሆነ የፍሎረሰንት መጠን ይጨምራል.

ይህ ዘዴ በናሙናው ውስጥ ያለውን የተወሰነ ቅደም ተከተል ቁጥር ለመገመት ያስችላል.በእያንዳንዱ ዑደት ውስጥ ባለ ሁለት-ክር ያለው የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ቁጥር በእጥፍ ይጨምራል።ስለዚህ, PCR በጣም ትናንሽ ናሙናዎችን ለመተንተን ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.

የፍሎረሰንት ሲግናልን ለመለካት ፣ tungsten halogen lamp፣ excitation filter፣ reflector፣ lens፣ ልቀት ማጣሪያ እና ቻርጅ የተጣመረ የመሳሪያ አጠቃቀም CCD ካሜራ።

ደረጃ 4 አግኝ

የፍሎረሰንት ሲግናልን ለመለካት ፣ tungsten halogen lamp፣ excitation filter፣ reflector፣ lens፣ ልቀት ማጣሪያ እና ቻርጅ የተጣመረ የመሳሪያ አጠቃቀም CCD ካሜራ።

ከመብራቱ ውስጥ ያለው የተጣራ ብርሃን በአንጸባራቂው ይገለጣል, በኮንዲነር ሌንስ ውስጥ ያልፋል እና በእያንዳንዱ ቀዳዳ መሃል ላይ ያተኩራል.ከዚያም ከጉድጓዱ ውስጥ የሚወጣው ፍሎረሰንት ከመስተዋቱ ላይ ይንፀባርቃል, በልቀቱ ማጣሪያ ውስጥ ያልፋል እና በሲሲዲ ካሜራ ተገኝቷል.በእያንዳንዱ የ PCR ዑደት ውስጥ, በራስ ተነሳሽነት ያለው የፍሎሮፎር ብርሃን በሲሲዲ ሊታወቅ ይችላል.

የተቀረጸውን ብርሃን ወደ ዲጂታል ዳታ ይለውጠዋል።ይህ ዘዴ የእውነተኛ ጊዜ PCR ተብሎ የሚጠራ ሲሆን የ PCR ምላሽ ሂደትን በእውነተኛ ጊዜ መከታተል ያስችላል።