PCR (polymerase chain reaction) ከ 30 ዓመታት በላይ ታሪክ ያለው ኢን-ቪትሮ ዲ ኤን ኤ ማጉላት ቴክኖሎጂዎች አንዱ ነው።

PCR ቴክኖሎጂ በሴቱስ፣ ዩኤስኤ በ1983 በአቅኚነት አገልግሏል። ሙሊስ በ1985 የ PCR የፈጠራ ባለቤትነት ጥያቄ አመልክቶ በዚያው ዓመት በሳይንስ ላይ የመጀመሪያውን PCR አካዳሚክ ወረቀት አሳትሟል።ሙሊስ በ1993 በኬሚስትሪ የኖቤል ሽልማት ተሸልሟል።

የ PCR መሰረታዊ መርሆች

PCR ኢላማ የሆኑትን የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ከአንድ ሚሊዮን ጊዜ በላይ ማጉላት ይችላል።መርሆው በዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዜዝ ስር ነው፣ የወላጅ ስትራንድ ዲ ኤን ኤ እንደ አብነት እና የተለየ ፕሪመር እንደ ማራዘሚያ መነሻ በመጠቀም።በብልቃጥ ውስጥ እንደ ጥርስ መቆረጥ፣ መሻር እና ማራዘሚያ ባሉ ደረጃዎች ይባዛል።ከወላጅ ፈትል አብነት ዲኤንኤ ጋር የሚደጋገፍ የሴት ልጅ ፈትል ዲ ኤን ኤ ሂደት።

መደበኛ PCR ሂደት በሦስት ደረጃዎች የተከፈለ ነው.

1.Denaturation: የዲ ኤን ኤ ድርብ ክሮች ለመለየት ከፍተኛ ሙቀት ይጠቀሙ.በዲኤንኤ ድርብ ክሮች መካከል ያለው የሃይድሮጂን ትስስር በከፍተኛ ሙቀት (93-98 ℃) ተሰብሯል።

2.Annealing፡- ባለ ሁለት ፈትል ዲ ኤን ኤ ከተለያየ በኋላ የሙቀት መጠኑን ዝቅ በማድረግ ፕሪመር ወደ ነጠላ-ፈትል ዲ ኤን ኤ ማያያዝ ይችላል።

3.ኤክስቴንሽን፡ የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ የሙቀት መጠኑ ሲቀንስ ከዲ ኤን ኤ ክሮች ላይ ከፕሪመርሮች ጋር ተጣምረው ተጨማሪ ገመዶችን ማቀናጀት ይጀምራል።ማራዘሚያው ሲጠናቀቅ አንድ ዑደት ይጠናቀቃል, እና የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ቁጥር በእጥፍ ይጨምራል

እነዚህን ሶስት እርምጃዎች ከ25-35 ጊዜ በመድገም የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ቁጥር በከፍተኛ ደረጃ ይጨምራል።

የ PCR ብልሃት የተለያዩ ፕሪመርሮች ለተለያዩ ዒላማ ጂኖች ሊነደፉ ስለሚችሉ የዒላማ ዘረ-መል (ጅን) ቁርጥራጮች በአጭር ጊዜ ውስጥ ሊጨመሩ ይችላሉ።

እስካሁን ድረስ PCR በሶስት ምድቦች ማለትም ተራ PCR, fluorescent quantitative PCR እና ዲጂታል PCR ሊከፈል ይችላል.

ተራ PCR የመጀመሪያው ትውልድ

የታለመውን ጂን ለማጉላት ተራ የ PCR ማጉያ መሳሪያ ይጠቀሙ እና ምርቱን ለማግኘት አጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ይጠቀሙ, የጥራት ትንተና ብቻ ሊደረግ ይችላል.

የመጀመሪያው ትውልድ PCR ዋና ጉዳቶች-

1.ያልሆኑ ማጉላት እና የውሸት አዎንታዊ ውጤቶች የተጋለጡ.

2.የማወቂያው ረጅም ጊዜ ይወስዳል እና ክዋኔው አስቸጋሪ ነው.

3.Only qualitative test ማድረግ ይቻላል

ሁለተኛ-ትውልድ ሪል-ታይም PCR

ሪል-ታይም PCR፣ እንዲሁም qPCR በመባል የሚታወቀው፣ የምላሽ ስርዓቱን ሂደት የሚጠቁሙ የፍሎረሰንት መመርመሪያዎችን ይጠቀማል፣ እና የተጨመሩ ምርቶችን በፍሎረሰንት ሲግናሎች ክምችት በኩል ይከታተላል እና ውጤቱን በፍሎረሰንት ከርቭ በኩል ይፈርዳል።በ Cq እሴት እና በመደበኛ ኩርባ እርዳታ ሊሰላ ይችላል.

የqPCR ቴክኖሎጂ የሚከናወነው በተዘጋ ስርዓት ውስጥ ስለሆነ የብክለት እድሉ ቀንሷል ፣ እና የፍሎረሰንት ምልክቱ በቁጥር ለመለየት ቁጥጥር ሊደረግበት ስለሚችል በክሊኒካዊ ልምምድ ውስጥ በሰፊው ጥቅም ላይ የዋለ እና በ PCR ውስጥ ዋነኛው ቴክኖሎጂ ሆኗል።

በእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉት የፍሎረሰንት ንጥረ ነገሮች በ TaqMan fluorescent probe፣ ሞለኪውላር ቢኮኖች እና የፍሎረሰንት ቀለም ሊከፋፈሉ ይችላሉ።

1) TaqMan የፍሎረሰንት መጠይቅ;

በ PCR ማጉላት ወቅት ጥንድ ፕሪመር በሚጨምርበት ጊዜ የተወሰነ የፍሎረሰንት መፈተሻ ይታከላል።መርማሪው ኦሊጎኑክሊዮታይድ ነው፣ እና ሁለቱም ጫፎች በሪፖርተር ፍሎረሰንት ቡድን እና በ quencher fluorescent ቡድን ምልክት ተደርጎባቸዋል።

መመርመሪያው ሳይበላሽ ሲቀር, በሪፖርተሩ ቡድን የሚወጣው የፍሎረሰንት ምልክት በማጥፋት ቡድን ይጠመዳል;በ PCR ማጉላት ወቅት የ 5′-3′ exonuclease እንቅስቃሴ የታክ ኢንዛይም ፈልቅቆ ምርመራውን በማዋረድ ዘጋቢውን ፍሎረሰንት ቡድን እና ኳንቸር ያደርገዋል የፍሎረሰንት ቡድን ተለያይቷል ስለዚህም የፍሎረሰንት ቁጥጥር ስርዓቱ የፍሎረሰንስ ምልክትን ይቀበላል ፣ ማለትም ፣ የዲ ኤን ኤ ገመድ በተጠናከረ ቁጥር ፣ የፍሎረሰንት ሞለኪውል ይመሰረታል ፣ የፍሎረሰንት ምልክት ይፈጠራል እና የፍሎረሰንት ሞለኪውል ይባላል። ከ PCR ምርት መፈጠር ጋር.

2) SYBR የፍሎረሰንት ቀለም;

በ PCR ምላሽ ስርዓት፣ ከመጠን በላይ የ SYBR ፍሎረሰንት ቀለም ይታከላል።የSYBR ፍሎረሰንት ቀለም ልዩ በሆነ መልኩ በዲኤንኤ ድርብ-ፈትል ውስጥ ካልተካተተ በኋላ የፍሎረሰንት ምልክት ያወጣል።በሰንሰለቱ ውስጥ ያልተካተተ የ SYBR ቀለም ሞለኪውል ምንም አይነት የፍሎረሰንት ምልክት አያወጣም, በዚህም የፍሎረሰንት ምልክትን ያረጋግጣል የ PCR ምርቶች መጨመር ከ PCR ምርቶች መጨመር ጋር ሙሉ በሙሉ ይመሳሰላል.SYBR የሚይዘው ከድርብ-ክር ዲ ኤን ኤ ጋር ብቻ ነው፣ ስለዚህ የማቅለጫው ከርቭ PCR ምላሽ የተወሰነ መሆኑን ለመወሰን ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል።

3) ሞለኪውላር ቢኮን;

በ 5 እና 3 ጫፎች ላይ ወደ 8 የሚጠጉ የፀጉር መርገጫዎችን የሚፈጥር ግንድ-ሉፕ ባለ ሁለት ምልክት የሆነ ኦሊጎኑክሊዮታይድ መጠይቅ ነው።በሁለቱም ጫፎች ላይ ያሉት የኑክሊክ አሲድ ቅደም ተከተሎች እርስ በርስ ተጣምረው ተጣምረው ነው, ይህም የፍሎረሰንት ቡድን እና የጠቋሚው ቡድን ጥብቅ ይሆናል.ቅርብ ፣ ምንም ፍሎረሰንት አይፈጠርም።

የ PCR ምርት ከተፈጠረ በኋላ, በማደንዘዣው ሂደት ውስጥ, የሞለኪውላር ቢኮን መካከለኛ ክፍል ከተወሰነ የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተል ጋር ተጣምሯል, እና የፍሎረሰንት ጂን ከኪንቸር ጂን ተለይቷል ፍሎረሰንት ይፈጥራል.

የሁለተኛ-ትውልድ PCR ዋና ጉዳቶች-

ስሜታዊነት አሁንም ይጎድላል፣ እና ዝቅተኛ ቅጂ ያላቸው ናሙናዎችን ማግኘት ትክክል አይደለም።

የበስተጀርባ እሴት ተጽእኖ አለ, ውጤቱም ለጣልቃ ገብነት የተጋለጠ ነው.

በምላሽ ስርዓት ውስጥ PCR inhibitors ሲኖሩ, የምርመራው ውጤት ለጣልቃ ገብነት የተጋለጠ ነው.

የሶስተኛ ትውልድ ዲጂታል PCR

ዲጂታል PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) የዒላማ ቅደም ተከተሎችን ቅጂ ቁጥር በመጨረሻ ነጥብ ማወቂያ ያሰላል እና የውስጥ መቆጣጠሪያዎችን እና መደበኛ ኩርባዎችን ሳይጠቀም ትክክለኛ ፍፁም የቁጥር ማወቂያን ማከናወን ይችላል።

ዲጂታል PCR የመጨረሻ ነጥብ ማወቂያን ይጠቀማል እና በሲቲ እሴት (የዑደት ገደብ) ላይ የተመካ አይደለም, ስለዚህ የዲጂታል PCR ምላሽ በአጉሊ መነፅር ቅልጥፍና ብዙም አይጎዳውም, እና ለ PCR ምላሽ አጋቾች ያለው መቻቻል በከፍተኛ ትክክለኛነት እና እንደገና መባዛት ይሻሻላል.

ምክንያት ከፍተኛ ትብነት እና ከፍተኛ ትክክለኛነት ባህሪያት, በቀላሉ PCR ምላሽ አጋቾቹ ጣልቃ አይደለም, እና ምርምር እና ማመልከቻ ነጥብ ሆኗል ያለ መደበኛ ምርቶች, እውነተኛ ፍጹም quantification ለማሳካት ይችላሉ.

እንደ የምላሽ ክፍል የተለያዩ ቅርጾች, በሶስት ዋና ዋና ዓይነቶች ሊከፈል ይችላል-ማይክሮፍሉዲክ, ቺፕ እና ነጠብጣብ ስርዓቶች.

1) ማይክሮፍሉይዲክ ዲጂታል PCR፣ mdPCR፡

በማይክሮፍሉዲክ ቴክኖሎጂ መሰረት የዲ ኤን ኤ አብነት ተለያይቷል።የማይክሮፍሉዲክ ቴክኖሎጂ ናሙናውን ናኖ-ማሻሻያ ወይም ትናንሽ ጠብታዎችን ማመንጨት ሊገነዘበው ይችላል፣ ነገር ግን ጠብታዎቹ ልዩ የማስተዋወቂያ ዘዴ ያስፈልጋቸዋል ከዚያም ከ PCR ምላሽ ስርዓት ጋር ይጣመራሉ።mdPCR ቀስ በቀስ በሌሎች ዘዴዎች ተቀባይነት አግኝቷል።

2) ጠብታ ላይ የተመሰረተ ዲጂታል PCR፣ ddPCR፡

የውሃ ውስጥ-ዘይት ጠብታ ማመንጨት ቴክኖሎጂን ይጠቀሙ ናሙናውን ወደ ጠብታዎች ለማቀነባበር እና የኒውክሊክ አሲድ ሞለኪውሎችን የያዘውን የምላሽ ስርዓት በሺዎች በሚቆጠሩ ናኖስኬል ጠብታዎች ይከፋፍሉት ፣ እያንዳንዱም ሊታወቅ የሚገባውን ኑክሊክ አሲድ ኢላማ ሞለኪውል አልያዘም ወይም ከአንድ እስከ ብዙ ኑክሊክ አሲድ ኢላማ ሞለኪውሎችን ይይዛል።

3) ቺፕ ላይ የተመሰረተ ዲጂታል PCR፣ cdPCR፡

የተቀናጀ የፈሳሽ መንገድ ቴክኖሎጂን ተጠቀም በሲሊኮን ዋፈር ወይም ኳርትዝ መስታወት ላይ ብዙ ማይክሮቱቦችን እና ማይክሮካቭቶችን ለመቅረጽ እና የመፍትሄውን ፍሰት በተለያዩ የመቆጣጠሪያ ቫልቮች ለመቆጣጠር እና የናሙና ፈሳሹን ተመሳሳይ መጠን ያላቸውን ናኖሜትር ወደ ምላሽ ጉድጓዶች ለዲጂታል PCR ምላሽ በመስጠት ፍፁም የቁጥር መጠን ለማግኘት ይከፋፍሉት።

የሦስተኛው ትውልድ PCR ዋና ጉዳቶች-

መሳሪያዎቹ እና ሬጀንቶቹ ውድ ናቸው።

የአብነት ጥራት መስፈርቶች ከፍተኛ ናቸው።የአብነት መጠኑ ከማይክሮ ሲስተሙ መጠን በላይ ከሆነ፣ ለመለካት የማይቻል ይሆናል፣ እና በጣም ትንሽ ከሆነ የቁጥር ትክክለኛነት ይቀንሳል።

የተለየ ያልሆነ ማጉላት ሲኖር የውሸት አዎንታዊ ውጤቶችም ሊፈጠሩ ይችላሉ።