RT-qPCR የሞለኪውላር ባዮሎጂ መሠረታዊ ሙከራ ነው፣ እና ሁሉም ሰው ሊያውቀው ይገባል።በዋነኛነት ሶስት እርከኖችን ያካትታል፡ አር ኤን ኤ ማውጣት፣ በግልባጭ ወደ ሲዲኤንኤ መገልበጥ እና የእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR።ምንም አይጠቅምም, ምን እየሆነ ነው?ላይ ችግር ሳይኖር አይቀርምየተገላቢጦሽ ግልባጭ ሙከራ!ምንም እንኳን የተገላቢጦሽ ግልባጭ ሙከራ አር ኤን ኤ፣ ዲኤንቲፒ፣ ፕሪመር እና መጨመር ብቻ የሚያስፈልገው ይመስላልየተገላቢጦሽ ግልባጭወደ ሴንትሪፉጅ ቱቦ እና በደንብ ይቀላቀሉ, ነገር ግን በእውነተኛው የአሠራር ሂደት ውስጥ, አሁንም ትኩረት ሊሰጣቸው የሚገቡ ብዙ ዝርዝሮች አሉ.ስለእሱ እንማር!

የ RNA ጥራትን እንዴት መወሰን እንደሚቻል?
ሲዲኤን ለማግኘት፣ የ RNA ጥራት ወሳኝ ነው!የአር ኤን ኤ ጥራት በሁለት ገፅታዎች ሊታወቅ ይችላል፡-
(1) የአር ኤን ኤ ትክክለኛነት፡የ RNA ትክክለኛነት በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ሊረጋገጥ ይችላል. ዩካርዮትን እንደ ምሳሌ ብንወስድ ሙሉው አጠቃላይ አር ኤን ኤ ሶስት ግልጽ ባንዶች አሉት፣ ከትልቅ እስከ ትንሽ ያለው ሞለኪውላዊ ክብደቶች 28S፣ 18S እና 5S ናቸው፣ እና 28S ከ18S በእጥፍ ይበልጣል።ሶስት ባንዶች ከታዩ ነገር ግን የባንዱ አይነት ደብዝዟል ወይም ስርጭት ማለት አር ኤን ኤው በከፊል ተበላሽቷል ማለት ነው።በዚህ ጊዜ፣ እባክዎን ወዲያውኑ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምላሽ ይስጡ እና የአብነት ግቤትን በትክክል ይጨምሩ።ትንሽ ሞለኪውላዊ ክብደት ያለው ወይም ባንድ የማይታይ ከሆነ አር ኤን ኤው ሙሉ በሙሉ ተበላሽቷል እና እንደገና ማውጣት ያስፈልገዋል።Agilent 2100 የአርኤንኤን ታማኝነት ከከፍተኛው ዲያግራም እና የ RIN እሴት ያሳያል።ኑክሊክ አሲድ ያልተነካ ከሆነ, የኤሌክትሮፊሮግራም መነሻው ጠፍጣፋ ነው;ኑክሊክ አሲድ በከፍተኛ ሁኔታ ከተበላሸ የመነሻ መስመሩ ያልተስተካከለ እና የበለጠ የመበስበስ ቁንጮዎች ይታያሉ ።የ RIN እሴት የአር ኤን ኤውን ትክክለኛነት ያንፀባርቃል, በ 0-10 ክልል ውስጥ, ትልቅ እሴቱ, የአር ኤን ኤ ጥራት የተሻለ ይሆናል.ደህና, የሙሉነት ደረጃ ከፍ ያለ ነው.
(2) የአር ኤን ኤ ንጽህና፡-የ OD260/280 ጥምርታ በ UV spectrophotometry ሊታወቅ ይችላል.የ OD260/280 ጥምርታ በ 1.9 እና 2.1 መካከል ከሆነ, ንፅህናው በጣም ጥሩ ነው.
ቀሪው ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ወደ ትክክለኛ ያልሆነ የቁጥር ውጤቶች ሊያመራ ይችላል።
አር ኤን ኤ ሲወጣ የምናገኘው አር ኤን ኤ ካልጸዳው ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ (ጂዲኤንኤ) ጋር ሊዋሃድ ይችላል።ስለዚህ፣ ከተገላቢጦሽ ወደ ጽሑፍ ከተገለበጠ በኋላ ያለው ሲዲኤን ከ ጋር ይደባለቃልጂዲኤንኤ.በታችኛው ተፋሰስ ወቅትqPCRምላሽ ፣ሲዲኤንኤእና gDNA በአንድ ጊዜ ሊጨምር ይችላል, ይህም በአንጻራዊ ሁኔታ አነስተኛ የሲቲ እሴት ያስከትላል, ስለዚህም ውጤቶቹ የተዛባ ሊሆኑ ይችላሉ.
ስለዚህ በዚህ ሁኔታ ውስጥ ምን ማድረግ አለብን?Foregeneይጠቁማል፡-
(1) በተገላቢጦሽ አር ኤን ኤ ላይ የጂኖም ማጽዳትን ያካሂዱ, ይህም በአር ኤን ኤ በሚወጣበት ጊዜ በአምድ ማውጣት ሊወገድ ይችላል;
(2) የወጣውን አር ኤን ኤ በDNase ያዙት።I , ግን በ EDTA ያቋርጡት;
የተገላቢጦሽ ግልባጭ reagentsከጂኖም ማጽጃ ሞጁሎች ጋር;

ለተገላቢጦሽ ጽሑፍ ፕሪመር እንዴት እንደሚመረጥ?
የተገላቢጦሽ ግልባጭ ፕሪመርሮች እንዲሁ በተቃራኒው የጽሑፍ ግልባጭ ምላሽ ውጤት ላይ ተጽዕኖ ያሳድራሉ።እንደ ለሙከራው ልዩ ሁኔታዎች በግልባጭ ለመቅዳት የዘፈቀደ ፕሪመር፣ ኦሊጎ ዲቲ ወይም ጂን-ተኮር ፕሪመር መምረጥ ይችላሉ።
(1) የተወሰኑ ግልባጮች: ጂን-ተኮር ፕሪመርቶች ይመከራሉ;
(2) ረጅም ቁርጥራጭ ግልባጮች: ኦሊጎ ዲቲ / ጂን-ተኮር ፕሪመርቶች ይመከራሉ;
(3) የረዥም ክፍል ግልባጮች ውስጣዊ ቁርጥራጮች: ጂን-ተኮር ፕሪመር / የዘፈቀደ ፕሪመር / የዘፈቀደ ፕሪመር + ኦሊጎ ዲቲ.የሚቀጥለው የqPCR ሙከራ ከተሰራ፣ Oligo dT ብቻውን መጠቀም አይቻልም፣ ምክንያቱም Oligo dT ብቻውን መጠቀም የ 3′ መጨረሻ አድልዎ ሊያስከትል ስለሚችል ትክክለኛ ያልሆነ የqPCR ሙከራ ውጤት ያስከትላል።
(4) ማይአርኤን: Stem-loop primers ወይም tailing primers መጠቀም ይቻላል.

የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምርት ሲዲ ኤን ኤ ለመለካት ስንት ጊዜ መሟሟት አለበት?
የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምርት ሲዲ ኤንኤን ካገኘ በኋላ፣ ሲዲኤንኤ ለqPCR ሙከራዎች ስንት ጊዜ መሟሟት እንዳለበት በጣም አስፈላጊ ነው።የሲዲኤንኤ ትኩረት በጣም ከፍተኛ ወይም በጣም ዝቅተኛ ከሆነ የማጉላት ብቃቱ ሊጎዳ ይችላል።የሲዲኤንኤ ትኩረትን መለካት ይቻላል እና እንዴትስ መደረግ አለበት?
(1) የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምርት የሲዲኤንኤ ትኩረት ሊለካ አይችልም ፣ ምክንያቱም ከሲዲኤንኤ ምርት በተጨማሪ ፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምርቱ እንዲሁ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ቀሪ ቋት ፣ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴስ ፣ ፕሪመር ፣ ወዘተ ይይዛል ፣ ይህም የማጎሪያውን የመለኪያ ውጤቶችን የሚያደናቅፍ እና OD260/280 ፣ OD260/ 230 ሬሾን አያንፀባርቅም።በዚህ ጊዜ አንዳንድ ጓደኞች ይላሉ, ከዚያም እኔ መንጻት በኋላ ትኩረት እለካለሁ;እዚህ, Foregene ሲዲኤንኤ እንዲጣራ አይመከርም, ምክንያቱም በተገላቢጦሽ የተገኘው የሲዲኤን ርዝመት የተለየ ስለሆነ እና አጭር ሲዲ ኤን ኤ በማጽዳት ውስጥ ይጠፋል.
(2) ታዲያ ምን ማድረግ?ከqPCR ሙከራ በፊት፣ የሲዲኤንኤው የዲሉሽን ቅልመት በቅድመ-ሙከራ ሊወሰን ይችላል።ለምሳሌ፡ የሲዲኤንኤ ስቶክ መፍትሄ፣ 10-fold dilution እና 100-fold dilution እንደ አብነት ለqPCR ሙከራዎች ተጠቀም እና ከ18-28 ባለው ክልል ውስጥ የዲሉሽን ፋክተርን ከሲቲ እሴት ጋር ምረጥ።

ማይአርኤን እንዴት ወደ ገለባ መገለበጥ አለበት?
ሚአርኤን ለፕሮቲን ኮድ የማይሰጥ 22 nt ያህል መጠን ያለው ባለ አንድ-ክር ያለው ትንሽ ሞለኪውል አር ኤን ኤ ነው።በአጭር ርዝማኔ ምክንያት, የተለመደው የqPCR ዘዴ በቀጥታ ለመለካት አስቸጋሪ ነው, ስለዚህ ብዙውን ጊዜ ሚአርኤን ማራዘም አስፈላጊ ነው;ለማይአርኤን በብዛት ጥቅም ላይ የሚውሉት የተገላቢጦሽ የመገለባበጥ ዘዴዎች የ stem-loop ዘዴ እና የጅራት ዘዴን ያካትታሉ።
የስቴም-ሉፕ ዘዴ ስቴም-ሉፕ ፕሪመርቶችን በመጨመር ሚአርኤንን ማራዘም ነው።ይህ የመፈለጊያ ዘዴ ከፍ ያለ ስሜታዊነት እና ልዩነት አለው፣ ነገር ግን የመለየት ጊዜ ዝቅተኛ ነው።አንድ የተገላቢጦሽ ግልባጭ አንድ ማይአርኤን እና የውስጥ ማጣቀሻን ብቻ ማወቅ ይችላል፤ጅራት የመደመር ዘዴ በሁለት የተዋቀረ ነው የተጠናቀቀው በሁለት ኢንዛይሞች የጋራ ተግባር ሲሆን እነዚህም ፖሊኤ ፖሊሜሬሴ እና የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት ናቸው።ፖሊኤ ፖሊመሬሴ ርዝመቱን ለመጨመር የፖሊኤ ጅራቶችን ወደ ሚአርኤን የመጨመር ሃላፊነት አለበት፣ እና በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴስ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምላሽ ይሰጣል።ይህ ዘዴ ከፍተኛ የፍተሻ ልቀት ያለው ሲሆን በርካታ ማይአርኤን እና የውስጥ ማጣቀሻዎችን በአንድ ተቃራኒ ቅጂ ማግኘት ይችላል፣ነገር ግን ትብነቱ እና ልዩነቱ በስቲም-loop ዘዴ ዝቅተኛ ነው።