PCR በብዛት ጥቅም ላይ የዋለ ኑክሊክ አሲድ ማጉላት ቴክኖሎጂ ሲሆን በስሜታዊነት እና ልዩነቱ ምክንያት በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላል።ነገር ግን፣ PCR ተደጋጋሚ የሙቀት መጨናነቅን ይፈልጋል እና በመሳሪያዎች እና በመሳሪያዎች ላይ የመተማመን ውስንነቶችን ማስወገድ አይችልም ፣ ይህም በክሊኒካዊ መስክ ሙከራ ውስጥ ያለውን መተግበሪያ ይገድባል።

ከ 1990 ዎቹ መጀመሪያ ጀምሮ ፣ ብዙ ላቦራቶሪዎች የሙቀት ጥንካሬን የማይፈልግ የማያቋርጥ የሙቀት ማጉላት ቴክኖሎጂ ማዳበር ጀመሩ።አሁን በ loop-mediated isothermal amplification ቴክኖሎጂ፣ ስትራንድ መተኪያ isothermal amplification ቴክኖሎጂ፣ rolling Circle isothermal ማጉያ ቴክኖሎጂ እና ኑክሊክ አሲድ ተከታታይ ጥገኝነት ፈጥረዋል።Isothermal ማጉያ ቴክኖሎጂ እና ሌሎች ቴክኖሎጂዎች. 

Loop-mediated isothermal ማጉያ

የማጉላት መርሆው የተመሰረተው ዲ ኤን ኤ በተለዋዋጭ ሚዛን በ 65 ዲግሪ ሴንቲግሬድ አካባቢ ውስጥ ነው በሚለው እውነታ ላይ ነው.ማንኛውም ፕሪመር ከመሠረት-የተጣመረ እና ወደ ድቡል-ክር ዲ ኤን ኤ ተጨማሪ ክፍል ሲዘረጋ፣ ሌላኛው ፈትል ተለያይቶ ነጠላ-ክር ይሆናል።

በዚህ የሙቀት መጠን፣ ዲ ኤን ኤ በስትራንድ-ማፈናቀል ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ላይ ለመመካት 4 የተወሰኑ ፕሪመርቶችን ይጠቀማል፣ የክር-የተፈናቀሉ ዲ ኤን ኤ ውህደት ያለማቋረጥ በራሱ እንዲሰራጭ ያደርጋል።

በመጀመሪያ 6 ልዩ ክልሎችን F3፣ F2፣ F1፣ B1፣ B2፣ B3 በዒላማው ዘረ-መል ላይ ይወስኑ እና ከዚያም በእነዚህ 6 ልዩ ክልሎች ላይ በመመስረት 4 ፕሪመርዎችን ይንደፉ (ከዚህ በታች ባለው ምስል ላይ እንደሚታየው)

የፊት የውስጥ ፕሪመር (ኤፍአይፒ) F1c እና F2 ያቀፈ ነው።

የኋለኛው የውስጥ ፕሪመር (BIP) B1c እና B2 ያቀፈ ነው፣ እና TTTT በመሃል ላይ እንደ ስፔሰር ጥቅም ላይ ይውላል።

የውጪ ፕሪመርሮች F3 እና B3 በቅደም ተከተል F3 እና B3 ክልሎች በዒላማው ዘረ-መል (ጅን) ላይ ያቀፉ ናቸው።

በ LAMP ምላሽ ስርዓት ውስጥ, የውስጣዊው ፕሪመር ትኩረት ከውጪው ፕሪመር ብዙ እጥፍ ይበልጣል.የውስጠኛው ፕሪመር መጀመሪያ ከአብነት ጋር ተጣምሮ ተጨማሪ ፈትል በማዋሃድ የዲኤንኤ ድርብ ፈትል ይፈጥራል።በመቀጠልም የውጪው ፕሪመር ከአብነት ጋር ተጣምሮ የዲኤንኤ ድርብ ፈትል ይፈጥራል።በ BstDNA ፖሊመሬሴ ተግባር ስር በውስጠኛው ፕሪመር የተዋሃደ ተጨማሪው ገመድ ይለቀቃል።ከተከታታይ ምላሾች በኋላ፣ የተጨማሪው ፈትል በመጨረሻ አንድ የዲ ኤን ኤ ገመድ ከ dumbbell መዋቅር ጋር ይመሰረታል።

የዲ ኤን ኤ ነጠላ ፈትል ራሱ ያለማቋረጥ የሽግግር ግንድ-ሉፕ መዋቅር ዲ ኤን ኤ ከተከፈተ ጫፍ ጋር ለመፍጠር እንደ አብነት ያገለግላል።የውስጥ እና የውጭ ፕሪመርሮች የሽግግር ግንድ-loop መዋቅር ዲ ኤን ኤ በቀጣይነት የክርን መፈናቀል እና የኤክስቴንሽን ምላሾችን ይመራሉ እና በመጨረሻም የተለያየ ርዝመት ያላቸው በርካታ ግንድ-loop አወቃቀሮችን ይመሰርታሉ።የዲኤንኤ ቅልቅል.

የ loop-mediated isothermal ማጉላት ጥቅሞች እና ጉዳቶች

የ LAMP ጥቅሞች:

(1) ከፍተኛ የማጉላት ብቃት፣ የታለመውን ዘረ-መል በ1ሰአት ውስጥ ከ1-10 ቅጂዎችን በብቃት ማጉላት የሚችል እና የማጉላት ብቃቱ ከተለመደው PCR ከ10-100 እጥፍ ይበልጣል።

(2) የምላሽ ጊዜ አጭር ነው, ልዩነቱ ጠንካራ ነው, እና ምንም ልዩ መሳሪያ አያስፈልግም.

የ LAMP ድክመቶች፡-

(፩) ለፕሪመርሮች የሚያስፈልጉት ነገሮች በተለይ ከፍተኛ ናቸው።

(2) የተጨመረው ምርት ለክሎኒንግ እና ቅደም ተከተል ጥቅም ላይ ሊውል አይችልም, ነገር ግን ለፍርድ ብቻ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.

(3) በጠንካራ ስሜታዊነት ምክንያት, ኤሮሶል (ኤሮሶል) ለመፍጠር ቀላል ነው, ይህም የውሸት አወንታዊ ውጤቶችን ያመጣል እና የፈተና ውጤቶቹን ይጎዳል.

Strand የማፈናቀል ማጉላት

ስትራንድ ማፈናቀል ማጉላት (ኤስዲኤ) ለመጀመሪያ ጊዜ በአሜሪካ ምሁር ዎከር በ1992 ባቀረበው የኢንዛይም ምላሽ ላይ የተመሠረተ የ in vitro isothermal DNA ማጉያ ዘዴ ነው።

የኤስዲኤ መሰረታዊ ስርዓት ገደብ ኤንዶኑክሊዝ፣ ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ ከስትራንድ ማፈናቀል እንቅስቃሴ፣ ሁለት ጥንድ ፕሪመር፣ ዲኤንቲፒ፣ እና ካልሲየም እና ማግኒዚየም ions እና ቋት ሲስተሞችን ያጠቃልላል።

የስትራንድ ማፈናቀል ማጉላት መርህ በኬሚካላዊ የተሻሻለው ገደብ የኢንዶኑክሊዝ እውቅና ቅደም ተከተል በዒላማው ዲኤንኤ በሁለቱም ጫፎች ላይ የተመሰረተ ነው።ኢንዶኑክሊዝ በ DNA strand ውስጥ ያለውን ክፍተት በማወቂያ ቦታው ላይ ይከፍታል, እና የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ክፍተቱን ያራዝመዋል 3′ End እና የሚቀጥለውን የዲ ኤን ኤ ገመድ ይተካዋል.

የተተካው ነጠላ የዲ ኤን ኤ ክሮች ከፕሪመርሮች ጋር ሊጣመሩ እና በዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ወደ ድርብ ክሮች ሊራዘሙ ይችላሉ።ይህ ሂደት ያለማቋረጥ ይደገማል, ስለዚህም የዒላማው ቅደም ተከተል በተቀላጠፈ መልኩ ይጨምራል.

የስትራንድ ማፈናቀል ማጉላት ቴክኖሎጂ ጥቅሞች እና ጉዳቶች

የኤስዲኤ ጥቅሞች

የማጉላት ብቃቱ ከፍተኛ ነው, የምላሽ ጊዜ አጭር ነው, ልዩነቱ ጠንካራ ነው, እና ምንም ልዩ መሳሪያ አያስፈልግም.

የኤስዲኤ ድክመቶች፡-

ምርቶቹ አንድ ወጥ አይደሉም፣ እና አንዳንድ ነጠላ-ክር እና ባለ ሁለት-ክር ምርቶች ሁልጊዜ የሚመረቱት በኤስዲኤ ዑደት ውስጥ ነው፣ እና በኤሌክትሮፊዮሬሲስ ሲታወቅ ጅራት መከሰቱ የማይቀር ነው።

Rolling ክበብ ማጉላት

ሮሊንግ ክብ ማጉላት (አርሲኤ) የሚቀርበው በክብ ክብ በመጠቀም በሽታ አምጪ ህዋሳትን ዲ ኤን ኤ የመቅዳት ዘዴን በመሳል ነው።እሱ የሚያመለክተው ነጠላ-ክበብ ክብ ዲ ኤን ኤ እንደ አብነት በቋሚ የሙቀት መጠን እና ልዩ የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ (እንደ Phi29)) በክብ የዲ ኤን ኤ ውህደት ተግባር ውስጥ የታለመውን ዘረ-መል ማጉላትን ለማሳካት ነው።

RCA ወደ መስመራዊ ማጉላት እና ገላጭ ማጉላት ሊከፋፈል ይችላል።የመስመራዊ RCA ውጤታማነት 10 ሊደርስ ይችላል⁵ጊዜ፣ እና የአርቢ RCA ቅልጥፍና 10 ሊደርስ ይችላል።⁹ጊዜያት.

ቀላል ልዩነት፣ ከታች ባለው ስእል ላይ እንደሚታየው፣ መስመራዊ ማጉላት ሀ 1 ፕሪመር ብቻ ይጠቀማል፣ አርቢ ማጉላት ለ 2 ፕሪምሮች አሉት።

መስመራዊ RCA እንዲሁ ነጠላ ፕሪመር RCA ተብሎም ይጠራል።ፕሪመር ከክብ ዲ ኤን ኤ ጋር ይጣመራል እና በዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ተግባር የተዘረጋ ነው።ምርቱ ከአንድ ዙር በሺዎች እጥፍ የሚረዝም ብዙ ቁጥር ያለው ተደጋጋሚ ነጠላ ፈትል ነው።

የመስመራዊ RCA ምርት ሁል ጊዜ ከመነሻ ፕሪመር ጋር የተገናኘ ስለሆነ የምልክቱ ቀላል መጠገን ትልቅ ጥቅም ነው።

ኤክስፖነንታል RCA፣ በተጨማሪም ሃይፐር ቅርንጫፍ ማጉላት HRCA (Hyper branched RCA) በመባልም ይታወቃል፣ በገለፃው RCA፣ አንድ ፕሪመር የ RCA ምርትን ያጠናክራል፣ ሁለተኛው ፕሪመር ከ RCA ምርት ጋር ይቀላቀላል እና ይረዝማል፣ እና መተኪያው ቀድሞውኑ ከ RCA ምርት ጋር የተሳሰረ ነው የታችኛው ተፋሰስ ፕሪምተሮች ገመዱን ያስረዝማሉ፣ እና ማራዘሚያ እና RCA የዴንድሪቲክ ምርትን ይደግማሉ።

የክበብ ኑክሊክ አሲድ ማጉላት ጥቅሞች እና ጉዳቶች

የ RCA ጥቅሞች:

ከፍተኛ ስሜታዊነት ፣ ጥሩ ልዩነት እና ቀላል ክዋኔ።

የ RCA ድክመቶች:

በምልክት ማወቂያ ጊዜ የጀርባ ችግሮች.በRCA ምላሽ ወቅት፣ ያልተዘዋወረ የመቆለፊያ መጠይቅ እና ያልተሰካው መጠይቅ አብነት ዲ ኤን ኤ ወይም አር ኤን ኤ አንዳንድ የጀርባ ምልክቶችን ሊያመነጭ ይችላል። 

Nዩክሊካይድ በቅደም ተከተል ላይ የተመሰረተ ማጉላት

በኑክሊክ አሲድ ቅደም ተከተል ላይ የተመሰረተ ማጉላት (NASBA) በ PCR ላይ የተመሰረተ አዲስ ቴክኖሎጂ ነው.ከ T7 አራማጅ ቅደም ተከተል ጋር በተጣመሩ ጥንድ የሚመራ ቀጣይነት ያለው እና isothermal ኑክሊክ አሲድ ማጉላት ነው።ቴክኖሎጂው አብነት አር ኤን ኤ በ 2 ሰአታት ውስጥ በ 109 ጊዜ ያህል ማጉላት ይችላል ፣ ይህም ከተለመደው PCR ዘዴ በ 1000 እጥፍ ከፍ ያለ እና ልዩ መሳሪያዎችን አያስፈልገውም።

ይህ ቴክኖሎጂ ልክ እንደታየ ለበሽታዎች ፈጣን ምርመራ ጥቅም ላይ ውሏል, እና ብዙ ኩባንያዎች በአሁኑ ጊዜ ይህን ዘዴ በአር ኤን ኤ መፈለጊያ መሳሪያዎች ውስጥ ይጠቀማሉ.

ምንም እንኳን አር ኤን ኤ ማጉላት የተገላቢጦሽ ግልባጭ PCR ቴክኖሎጂን ቢጠቀምም፣ NASBA የራሱ ጥቅሞች አሉት፡ በአንፃራዊነት በቋሚ የሙቀት ሁኔታዎች ውስጥ ሊከናወን ይችላል፣ እና ከባህላዊ PCR ቴክኖሎጂ የበለጠ የተረጋጋ እና ትክክለኛ ነው።

ምላሹ በ 41 ዲግሪ ሴልሺየስ ሲሆን AMV (የአቪያን ማይሎብላስቶሲስ ቫይረስ) የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት, RNase H, T7 አር ኤን ኤ ፖሊመሬሴ እና ጥንድ ፕሪመር ያስፈልገዋል.

ሂደቱ በዋናነት የሚከተሉትን ያካትታል:

ወደፊት ፕሪመር የቲ 7 አራማጅ ማሟያ ቅደም ተከተል ይዟል።በምላሹ ጊዜ የፊት ፕሪመር ከአር ኤን ኤ ስትራንድ ጋር ይጣመራል እና በኤኤምቪ ኢንዛይም ተስተካክሎ የዲኤንኤ-አር ኤን ኤ ድርብ ፈትል ይፈጥራል።

RNase H አር ኤን ኤውን በድብልቅ ፈትል ውስጥ በማፍጨት ነጠላ-ክር ያለው ዲኤንኤ ይይዛል።

በተገላቢጦሽ ፕሪመር እና በኤኤምቪ ኢንዛይም ተግባር ስር የዲ ኤን ኤ ድርብ ፈትል የ T7 አስተዋዋቂ ቅደም ተከተል ይመሰረታል።

በቲ 7 አር ኤን ኤ ፖሊመሬሴ ተግባር ስር የመገልበጥ ሂደቱ ተጠናቅቋል እና ከፍተኛ መጠን ያለው አር ኤን ኤ ይዘጋጃል.

የ NASBA ጥቅሞች:

(1) የእሱ ፕሪመር የ T7 ፕሮሞተር ቅደም ተከተል አለው, ነገር ግን የውጭ ባለ ሁለት ገመድ ዲ ኤን ኤ ቲ 7 አራማጅ ቅደም ተከተል የለውም እና ሊጨምር አይችልም, ስለዚህ ይህ ቴክኖሎጂ ከፍተኛ ልዩነት እና ስሜታዊነት አለው.

(2) NASBA የተገላቢጦሹን የጽሑፍ ግልባጭ ሂደት በቀጥታ በማጉላት ምላሽ ውስጥ ያካትታል፣ ይህም የምላሽ ጊዜን ያሳጥራል።

የ NASBA ጉዳቶች፡-

(1) የምላሽ አካላት የበለጠ የተወሳሰቡ ናቸው።

(2) ምላሹን ከፍ ለማድረግ ሦስት ዓይነት ኢንዛይሞች ያስፈልጋሉ።