ሪል ታይም PCR፣ እንዲሁም መጠናዊ PCR ወይም qPCR በመባልም ይታወቃል፣ የ PCR ማጉላት ምርቶችን የእውነተኛ ጊዜ ክትትል እና ትንተና ዘዴ ነው።
የቁጥራዊ PCR ቀላል ቀዶ ጥገና ፣ ፈጣን እና ምቹ ፣ ከፍተኛ ስሜታዊነት ፣ ጥሩ ተደጋጋሚነት እና ዝቅተኛ የብክለት መጠን ጥቅሞች ስላለው በሕክምና ምርመራ ፣ የመድኃኒት ውጤታማነት ግምገማ ፣ የጂን አገላለጽ ምርምር ፣ ትራንስጄኒክ ምርምር ፣ የጂን ማወቂያ ፣ በሽታ አምጪ ተህዋስያንን ፣ እንስሳትን እና እፅዋትን መለየት በሰፊው ጥቅም ላይ ይውላል።, የምግብ ምርመራ እና ሌሎች መስኮች.
ስለዚህ በህይወት ሳይንስ ውስጥ በመሠረታዊ ምርምር ላይ የተሰማሩ ወይም የመድኃኒት ኩባንያዎች ፣ የእንስሳት እርባታ ኩባንያዎች ፣ የምግብ ኩባንያዎች ፣ ወይም የመግቢያ መውጫ ቁጥጥር እና የኳራንቲን ቢሮዎች ሠራተኞች ፣ የአካባቢ ቁጥጥር ክፍሎች ፣ ሆስፒታሎች እና ሌሎች ክፍሎች ፣ የበለጠ ወይም ያነሰ ይጋለጣሉ ወይም የቁጥር PCRን እውቀት ማወቅ ያስፈልግዎታል።

የእውነተኛ ጊዜ PCR መርህ

ሪል ታይም PCR የፍሎረሰንት ንጥረነገሮች ወደ PCR ምላሽ ስርዓት የሚጨመሩበት ዘዴ ሲሆን በ PCR ምላሽ ሂደት ውስጥ ያለው የፍሎረሰንት ሲግናል መጠን በእውነተኛ ጊዜ በ PCR መሳሪያ ቁጥጥር የሚደረግበት ሲሆን በመጨረሻም የሙከራ መረጃው ተተነተነ እና ተስተካክሏል።

【የማጉላት ኩርባ】የ PCR ተለዋዋጭ ሂደትን የሚገልጽ ኩርባ ነው።የ PCR የማጉላት ኩርባ በትክክል መደበኛ ገላጭ ኩርባ አይደለም፣ ግን የሲግሞይድ ከርቭ ነው።

[የመድረክ ደረጃ የማጉላት ኩርባ]የ PCR ዑደቶች ቁጥር መጨመር, የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬዜሽን ማነስ, የዲኤንቲፒ እና የፕሪመርስ መሟጠጥ, እና የምላሽ ፓይሮፎስፌት በተባለው ምላሽ, ወዘተ, PCR ሁልጊዜ በከፍተኛ ፍጥነት አይስፋፋም., እና በመጨረሻ ወደ አምባ ውስጥ ይገባል.

[የማጉላት ከርቭ ሰፊ የእድገት ክልል]የፕላቶው ደረጃ በጣም ቢለያይም, በተወሰነ ክልል ውስጥ በተወሰነ ክልል ውስጥ የአጉሊ መነፅር እድገት ክልል, ተደጋጋሚነት በጣም ጥሩ ነው, ይህም ለ PCR አሃዛዊ ትንተና በጣም አስፈላጊ ነው.

[የመገደብ ዋጋ እና የሲቲ እሴት]የፍሎረሰንስ ማወቂያን ገደብ በማጉላት ከርቭ የሰፋፊ የእድገት ቦታ ላይ በተገቢው ቦታ ላይ እናስቀምጣለን ፣ ማለትም የመነሻ እሴት (ትሬስሆል)።የመተላለፊያ እሴቱ መገናኛ እና የማጉላት ጥምዝ የሲቲ እሴት ነው, ማለትም, የሲቲ እሴቱ የመነሻ እሴቱ ሲደረስ የዑደቶችን ብዛት (የመግጠሚያ ዑደት) ያመለክታል.

ከታች ያለው ግራፍ በገደብ መስመር እና በማጉላት ከርቭ፣ threshold እና ሲቲ እሴት መካከል ያለውን ግንኙነት በግልፅ ያሳያል።

【እንዴት ማስላት ይቻላል?】

የሲቲ እሴት ከመጀመሪያዎቹ አብነቶች ብዛት ሎጋሪዝም ጋር የተገላቢጦሽ መስመራዊ ግንኙነት እንዳለው በሂሳብ ቲዎሪ ተረጋግጧል።ሪል ታይም PCR PCR የማጉላት ምርቶችን በቅጽበት ይከታተላል እና በገለፃው የማጉላት ደረጃ ላይ ያካቸዋል።

ለእያንዳንዱ የ PCR ዑደት፣ ዲ ኤን ኤው በ 2 ጊዜ በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል፣ እና ብዙም ሳይቆይ አምባ ላይ ደረሰ።

የዲ ኤን ኤው የመነሻ መጠን A ነው ብለን በማሰብ₀ ከኤን ዑደቶች በኋላ፣ የዲኤንኤ ምርት ንድፈ ሃሳባዊ መጠን እንደሚከተለው ሊገለፅ ይችላል፡-

A _n =A ₀ ×2ⁿ

ከዚያም የመጀመርያው የዲኤንኤ መጠን A 0 በበዛ ቁጥር የተጨመረው ምርት መጠን ቶሎ ቶሎ የመለየት እሴት ይደርሳል A , እና አን ሲደርሱ የዑደቶች ብዛት የሲቲ እሴት ነው.ያም ማለት የመጀመርያው የዲኤንኤ መጠን A 0 በጨመረ ቁጥር የማጉላት ኩርባው ከፍ ይላል እና በተመሳሳይ መልኩ የሚፈለገው የዑደት ቁጥር n ያነሰ ነው።

የዲ ኤን ኤ መጠንን ከብዙ ወደ ያነሰ ለመጀመር በቅደም ተከተል የሪል ታይም ፒሲአር አብነት አድርገን እንጠቀማለን።በሲቲ እሴት እና በመነሻ አብነቶች ብዛት ሎጋሪዝም መካከል ባለው ቀጥተኛ ግንኙነት፣ ሀ(መደበኛ ኩርባ) ሊፈጠር ይችላል.

የናሙናውን የሲቲ እሴት ባልታወቀ ትኩረት ወደ መደበኛው ከርቭ በመተካት የናሙናውን የመጀመሪያ አብነት መጠን ካልታወቀ ትኩረት ማግኘት ይቻላል ይህም የሪል ታይም PCR የቁጥር መርህ ነው።

የእውነተኛ ጊዜ PCR ማወቂያ ዘዴ

ሪል ታይም PCR በምላሽ ስርዓቱ ውስጥ ያለውን የፍሎረሰንት መጠን በመለየት የ PCR ማጉላት ምርቶችን ያገኛል።

የፍሎረሰንት ቀለም መክተት ዘዴ መርህ】

የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎችእንደ ቲቢ ግሪን ® ያለ ልዩ በሆነ መልኩ በ PCR ሲስተም ውስጥ ባለ ሁለት ፈትል ያለው ዲ ኤን ኤ እና በሚታሰርበት ጊዜ ፍሎረስ ሊጣመሩ ይችላሉ።

በምላሽ ስርዓቱ ውስጥ ያለው የፍሎረሰንት መጠን ከ PCR ዑደቶች መጨመር ጋር በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል።የፍሎረሰንት ጥንካሬን በመለየት በምላሽ ስርዓቱ ውስጥ ያለው የዲኤንኤ ማጉላት መጠን በእውነተኛ ጊዜ ቁጥጥር ሊደረግበት ይችላል እና ከዚያ በናሙናው ውስጥ ያለው የመነሻ አብነት መጠን በተቃራኒው ሊገመት ይችላል።

【የፍሎረሰንት መፈተሻ ዘዴ መርህ】

የፍሎረሰንት መፈተሻየኑክሊክ አሲድ ቅደም ተከተል ከፍሎረሰንት ቡድን ጋር በ 5′ መጨረሻ ላይ እና በ 3′ መጨረሻ ላይ የሚጠፋ ቡድን ፣ እሱም በተለይ ከአብነት ጋር ሊጣመር ይችላል።ፍተሻው ሳይበላሽ ሲቀር, በፍሎረፎሩ የሚወጣው ፍሎረሰንት በ quenching ቡድን ይጠፋል እና ፍሎረሰንት ማድረግ አይችልም.ፍተሻው ሲበሰብስ የፍሎረሰንት ንጥረ ነገር ተለያይቶ ፍሎረሰንት ያወጣል።

የፍሎረሰንት መፈተሻ ወደ PCR ምላሽ መፍትሄ ይታከላል።በማጣራት ሂደት ውስጥ የፍሎረሰንት ፍተሻ ከአብነት ልዩ ቦታ ጋር ይያያዛል።በማራዘሚያው ሂደት ውስጥ፣ የፒሲአር ኢንዛይም 5′→3′ exonuclease እንቅስቃሴ ከአብነት ጋር የተዳቀለውን የፍሎረሰንት መፈተሻ መበስበስ ይችላል፣ እና የፍሎረሰንት ንጥረ ነገር ፍሎረሰንት ለማውጣት ተለያይቷል።በምላሽ ስርዓቱ ውስጥ የፍተሻውን የፍሎረሰንት መጠን በመለየት የ PCR ምርትን የማጉላት መጠን የመቆጣጠር ዓላማ ሊሳካ ይችላል።

【የፍሎረሰንት መፈለጊያ ዘዴ ምርጫ】

ከከፍተኛ ግብረ-ሰዶማዊነት ጋር ቅደም ተከተሎችን ለመለየት እና እንደ SNP ትየባ ትንታኔ ያሉ ባለብዙ ፒሲአር ማወቂያን ለማከናወን ጥቅም ላይ የሚውል ከሆነ የፍሎረሰንት መፈተሻ ዘዴው ሊተካ የማይችል ነው።
ለሌሎች የእውነተኛ ጊዜ PCR ሙከራዎች ቀላል፣ ቀላል እና አነስተኛ ዋጋ ያለው የፍሎረሰንት ቺሜራ ዘዴ መጠቀም ይቻላል።

probesStrong Specificity፣ multiplex PCR የሚችል

ጉድለት

ለማጉላት ከፍተኛ ልዩ መስፈርቶች;

multiplex PCR ሊከናወን አይችልም የተወሰኑ መመርመሪያዎችን መንደፍ ያስፈልጋል, ከፍተኛ ወጪ;

አንዳንድ ጊዜ የመመርመሪያ ንድፍ አስቸጋሪ ነው

ተዛማጅ ምርቶች፡