የሲቲ እሴት በጣም አስፈላጊው የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR የውጤት አቀራረብ ነው።የጂን መግለጫ ልዩነቶችን ወይም የጂን ቅጂ ቁጥርን ለማስላት ጥቅም ላይ ይውላል.ስለዚህ የፍሎረሰንስ መጠየቂያ የሲቲ እሴት ምን ያህል ምክንያታዊ ነው ተብሎ ይታሰባል?የሲቲ እሴትን ውጤታማ ክልል እንዴት ማረጋገጥ ይቻላል?
ሲቲ እሴት ምንድን ነው?
በ qPCR ማጉላት ሂደት ውስጥ, የተጨመረው ምርት የፍሎረሰንት ምልክት በተቀመጠው የፍሎረሰንት ገደብ ላይ ሲደርስ ተጓዳኝ የማጉላት ዑደቶች (ሳይክል ጣራ) ቁጥር.C ሲክል እና ቲ ማለት ደፍን ያመለክታል።በቀላል አነጋገር፣ የሲቲ እሴቱ የመነሻ አብነት ማጉላት በqPCR ውስጥ የተወሰነ የምርት መጠን ሲደርስ የሚዛመዱ የዑደቶች ብዛት ነው።"የተወሰነ መጠን ያለው ምርት" ተብሎ የሚጠራው በኋላ ላይ የበለጠ ይብራራል.
የሲቲ እሴት ምን ያደርጋል?
1. በገለፃ ማጉላት ፣ በአብነት መጠን እና በሲቲ እሴት መካከል ያለው ግንኙነት
በሐሳብ ደረጃ፣ በqPCR ውስጥ ያሉ ጂኖች ከተወሰኑ ዑደቶች በኋላ በገለፃ ማጉላት ይከማቻሉ።በማጉላት ዑደቶች ብዛት እና በምርቶቹ መጠን መካከል ያለው ግንኙነት፡ የተጨመረው የምርት መጠን = የመጀመሪያ አብነት መጠን × (1+E) ዑደት ቁጥር ነው።ሆኖም፣ የqPCR ምላሽ ሁል ጊዜ ተስማሚ በሆነ ሁኔታ ላይ አይደለም።የተጨመረው ምርት መጠን ወደ "የተወሰነ የምርት መጠን" ሲደርስ, በዚህ ጊዜ የዑደቶች ብዛት የሲቲ እሴት ነው, እና በአርቢ ማጉላት ጊዜ ውስጥ ነው.በሲቲ እሴት እና በመነሻ አብነት መጠን መካከል ያለው ግንኙነት፡ በአብነት ሲቲ እሴት እና በአብነት የመነሻ ቅጂ ቁጥር ሎጋሪዝም መካከል ቀጥተኛ ግንኙነት አለ።የመነሻ አብነት ትኩረትን ከፍ ባለ መጠን የሲቲ እሴት ያነሰ ነው;ዝቅተኛው የመነሻ አብነት ትኩረት, የሲቲ እሴት ይበልጣል.
2.Amplification ከርቭ፣ fluorescence threshold እና የተወሰነ PCR ምርት መጠን
የqPCR የማጉላት ምርት መጠን በቀጥታ የሚቀርበው በፍሎረሰንት ምልክት ማለትም በማጉላት ከርቭ ነው።በ PCR የመጀመሪያ ደረጃ ላይ ማጉላት ተስማሚ ሁኔታዎች ውስጥ ነው, የዑደቶች ብዛት ትንሽ ነው, የምርት ክምችት ትንሽ ነው, እና የፍሎረሰንት ደረጃ ከፍሎረሰንት ዳራ በግልጽ ሊታወቅ አይችልም.ከዚያ በኋላ, ፍሎረሰንት ይጨምራል እና ወደ ገላጭ ደረጃ ውስጥ ይገባል.የ PCR ምርት መጠን በተወሰነ ነጥብ ላይ ሊገኝ የሚችለው PCR ምላሽ በገለፃ ደረጃ ላይ ብቻ ሲሆን ይህም እንደ "የተወሰኑ የምርት መጠን" ሆኖ ሊያገለግል ይችላል, እና የአብነት የመጀመሪያ ይዘት ከዚህ ሊወሰድ ይችላል.ስለዚህ, ከተወሰነ የምርት መጠን ጋር የሚዛመደው የፍሎረሰንስ ምልክት ጥንካሬ የፍሎረሰንት ገደብ ነው.
በ PCR መገባደጃ ላይ፣ የማጉላት ኩርባው ገላጭ ማጉላትን አያሳይም፣ እና ወደ መስመራዊ ደረጃ እና የፕላታ ደረጃ ውስጥ ይገባል።
3. የሲቲ እሴቶችን እንደገና ማባዛት
የ PCR ዑደት የሲቲ እሴቱ የዑደት ቁጥር ላይ ሲደርስ፣ ወደ እውነተኛው የአርቢ ማጉላት ጊዜ ገብቷል።በዚህ ጊዜ, ትንሹ ስህተቱ አልተጨመረም, ስለዚህ የሲቲ እሴት እንደገና መባዛት በጣም ጥሩ ነው, ማለትም, ተመሳሳይ አብነት በተለያየ ጊዜ ወይም በተለያዩ ቱቦዎች ውስጥ በተመሳሳይ ጊዜ ይጨምራል.ማጉላት፣ የተገኘው የሲቲ እሴት ቋሚ ነው።
1.Amplification ቅልጥፍና ኤን
PCR ማጉላት ቅልጥፍና የሚያመለክተው ፖሊሜሬዝ ዘረ-መል (ጅን) ወደ ማጉያ (amplicon) የሚቀይርበትን ቅልጥፍና ነው።አንድ የዲ ኤን ኤ ሞለኪውል ወደ ሁለት የዲኤንኤ ሞለኪውሎች ሲቀየር የማጉላት ብቃቱ 100% ነው።የማጉላት ቅልጥፍና በተለምዶ እንደ ኤን.ቀጣይ ርዕሶችን ለመተንተን ለማመቻቸት, የማጉላት ቅልጥፍናን የሚነኩ ምክንያቶች በአጭሩ ቀርበዋል.
| ተጽዕኖ የሚያሳድሩ ነገሮች | ማብራሪያ | እንዴት እንደሚፈርድ? |
| A. PCR አጋቾቹ | 1. አብነት ዲ ኤን ኤ የ PCR ምላሽን የሚገቱ እንደ ፕሮቲን ወይም ሳሙና ያሉ ንጥረ ነገሮችን ይዟል።2. ከተገላቢጦሽ ግልባጭ በኋላ ያለው ሲዲኤንኤ ከፍተኛ የአብነት አር ኤን ኤ ወይም የ RT reagent ክፍሎች ይዟል፣ ይህ ደግሞ ተከታዩን PCR ምላሽ ሊገታ ይችላል። | 1. ብክለት መኖር አለመኖሩን የA260/A280 እና A260/A230 ወይም RNA electrophoresis ሬሾን በመለካት ማረጋገጥ ይቻላል።2. ሲዲ ኤን ኤ ከተገለበጠ በኋላ በተወሰነ ሬሾ መሰረት የተበረዘ ይሁን። |
| ለ. ትክክለኛ ያልሆነ የፕሪመር ንድፍ | ፕሪመርስ በብቃት አያጠፋም። | ፕሪመር-ዲመርስ ወይም የፀጉር መቆንጠጫዎች፣ አለመዛመጃዎች እና አንዳንድ ጊዜ የውስጥ ንድፎችን የሚሸፍኑ ፕሪመርቶችን ያረጋግጡ። |
| ሐ. ተገቢ ያልሆነ PCR ምላሽ ፕሮግራም ንድፍ | 1. ፕሪመርስ ውጤታማ በሆነ መንገድ መቀልበስ አይችሉም2. የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬዜሽን በቂ አለመሆን 3. የረዥም ጊዜ ከፍተኛ ሙቀት የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ እንቅስቃሴ ቀንሷል | 1. የማስታወሻው የሙቀት መጠን ከዋናው የቲኤም ዋጋ ከፍ ያለ ነው2. የቅድመ-ዲኒዩሽን ጊዜ በጣም አጭር ነው 3. የምላሽ ሂደቱ የእያንዳንዱ ደረጃ ጊዜ በጣም ረጅም ነው |
| መ. የሪኤጀንቶች ወይም የቧንቧ ስህተቶች በቂ ያልሆነ ድብልቅ | በምላሽ ስርዓት ውስጥ ፣ የ PCR ምላሽ አካላት አካባቢያዊ ትኩረት በጣም ከፍተኛ ወይም ያልተስተካከለ ነው ፣ ይህም የ PCR ማጉላት ገላጭ ያልሆነ ማጉላት ያስከትላል። | |
| ኢ. የአምፕሊኮን ርዝመት | የአምፕሊኮን ርዝመት በጣም ረጅም ነው ከ 300ቢፒ በላይ ነው እና የማጉላት ብቃቱ ዝቅተኛ ነው | የአምፕሊኮን ርዝመት ከ80-300ቢ/ፒ መካከል መሆኑን ያረጋግጡ |
| ረ. የqPCR reagents ተጽዕኖ | በሪአጀንቱ ውስጥ ያለው የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ መጠን ዝቅተኛ ነው ወይም በመጠባበቂያው ውስጥ ያለው የ ions ክምችት አልተመቻቸም ፣ በዚህም ምክንያት የታክ ኢንዛይም እንቅስቃሴ ከፍተኛውን አልደረሰም ። | የማጉላት ብቃትን በመደበኛ ኩርባ መወሰን |
2.የሲቲ እሴቶች ክልል
የሲቲ እሴቶች ከ15-35 ይደርሳሉ።የሲቲ እሴቱ ከ 15 በታች ከሆነ, ማጉላት በመነሻ ጊዜ ገደብ ውስጥ እንደሆነ እና የፍሎረሰንት ገደብ ላይ እንዳልደረሰ ይቆጠራል.በሐሳብ ደረጃ፣ በሲቲ እሴት እና በአብነት የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር ሎጋሪዝም መካከል ቀጥተኛ ግንኙነት አለ፣ ማለትም፣ መደበኛ ኩርባ።በመደበኛ ኩርባ በኩል የማጉላት ብቃቱ 100% ሲሆን የጂን ነጠላ ቅጂ ቁጥርን ለመለካት የሚሰላው ሲቲ እሴት 35 አካባቢ ነው። ከ 35 በላይ ከሆነ የአብነት የመጀመሪያ ቅጂ ቁጥር በንድፈ ሀሳብ ከ 1 ያነሰ ነው ፣ ይህም ትርጉም የለውም ተብሎ ሊወሰድ ይችላል።
ለተለያዩ የጂን ሲቲ ክልሎች በጂን ቅጂ ቁጥር ልዩነት እና በመነሻ አብነት መጠን የማጉላት ቅልጥፍና ምክንያት ለጂን መደበኛ ከርቭ ማድረግ እና የጂን መስመራዊ መፈለጊያ ክልልን ማስላት ያስፈልጋል።
3.በሲቲ እሴት ላይ ተጽዕኖ የሚያሳድሩ ነገሮች
በማጉላት ዑደቶች ብዛት እና በምርቱ መጠን መካከል ካለው ግንኙነት: የተጨመረው ምርት መጠን = የመነሻ አብነት × (1 + ኤን) ዑደት ቁጥር ፣ በጥሩ ሁኔታዎች ውስጥ ፣ የመነሻ አብነት እና ኤን መጠን በሲቲ እሴት ላይ አሉታዊ ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ማየት ይቻላል ።የአብነት ጥራት ወይም የማጉላት ቅልጥፍና ልዩነት የሲቲ እሴቱ በጣም ትልቅ ወይም በጣም ትንሽ እንዲሆን ያደርገዋል።
4.Ct ዋጋ በጣም ትልቅ ወይም በጣም ትንሽ ነው
የልጥፍ ሰዓት፡- ፌብሩዋሪ-22-2023
