ሞለኪውላር ምርመራ ቴክኖሎጂ ሞለኪውላር ባዮሎጂ ዘዴዎችን ይጠቀማል የሰው አካል እና የተለያዩ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን የጄኔቲክ ቁሳቁሶችን አገላለጽ እና አወቃቀሩን በመለየት በሽታዎችን የመተንበይ እና የመመርመር ዓላማን ለማሳካት።

በቅርብ ዓመታት ውስጥ የሞለኪውላር ምርመራ ቴክኖሎጂን በማሻሻል እና በመድገም, የሞለኪውላር ዲያግኖስቲክስ ክሊኒካዊ አተገባበር ከጊዜ ወደ ጊዜ እየጨመረ እና ጥልቅ እየሆነ መጥቷል, እና የሞለኪውላር ምርመራ ገበያ ፈጣን የእድገት ጊዜ ውስጥ ገብቷል.

ደራሲው በገበያ ላይ ያሉትን የተለመዱ ሞለኪውላር መመርመሪያ ቴክኖሎጂዎችን ጠቅለል አድርጎ በሶስት ክፍሎች የተከፈለ ሲሆን የመጀመሪያው ክፍል የ PCR ቴክኖሎጂን ያስተዋውቃል, ሁለተኛው ክፍል የኒውክሊክ አሲድ ኢሶተርማል ማጉያ ቴክኖሎጂን ያስተዋውቃል, ሁለተኛው ክፍል ደግሞ ተከታታይ ቴክኖሎጂን ያስተዋውቃል.

01

ክፍል I: PCR ቴክኖሎጂ

PCR ቴክኖሎጂ

PCR (polymerase chain reaction) ከ 30 ዓመታት በላይ ታሪክ ያለው በብልቃጥ ውስጥ ከሚገኙት የዲኤንኤ ማጉላት ቴክኖሎጂዎች አንዱ ነው።

የ PCR ቴክኖሎጂ በ1983 በሴቱስ፣ ዩኤስኤ ነዋሪ በሆነው በካሪ ሙሊስ በአቅኚነት አገልግሏል።ሙሊስ እ.ኤ.አ. በ1985 ለ PCR የፈጠራ ባለቤትነት ማመልከቻ አመልክቶ በዚያው ዓመት በሳይንስ ላይ የመጀመሪያውን PCR አካዳሚክ ወረቀት አሳትሟል።ሙሊስ በ1993 በኬሚስትሪ የኖቤል ሽልማት አሸንፏል።

የ PCR መሰረታዊ መርሆች

PCR ኢላማ የሆኑትን የዲኤንኤ ቁርጥራጮች ከአንድ ሚሊዮን ጊዜ በላይ ማጉላት ይችላል።መርሆው በዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬሴስ ካታላይዝስ ስር የወላጅ ፈትል ዲ ኤን ኤ እንደ አብነት ጥቅም ላይ ይውላል, እና የተለየ ፕሪመር ለማራዘሚያ መነሻ ሆኖ ያገለግላል.በብልቃጥ ውስጥ እንደ ጥርስ መቆረጥ፣ መሻር እና ማራዘሚያ ባሉ ደረጃዎች ይባዛል።ከወላጅ ፈትል አብነት ዲኤንኤ ጋር የሚደጋገፍ የሴት ልጅ ፈትል ዲ ኤን ኤ ሂደት።

መደበኛ PCR ሂደት በሦስት ደረጃዎች የተከፈለ ነው.

1. Denaturation: ዲ ኤን ኤ ድርብ ፈትል ለመለየት ከፍተኛ ሙቀት ይጠቀሙ.በዲኤንኤ ድርብ ክሮች መካከል ያለው የሃይድሮጂን ትስስር በከፍተኛ ሙቀት (93-98 ° ሴ) ተሰብሯል።

2. ማደንዘዣ፡- ባለ ሁለት ፈትል ዲ ኤን ኤ ከተለያየ በኋላ የሙቀት መጠኑ ይቀንሳል ስለዚህም ፕሪመር ወደ ነጠላ-ክር ያለው ዲ ኤን ኤ ማያያዝ ይችላል።

3. ማራዘሚያ፡- የዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ የሙቀት መጠኑ ሲቀንስ ከዲ ኤን ኤ ክሮች ላይ ከፕሪመርሮች ጋር የተያያዙ ተጨማሪ ገመዶችን ማቀናጀት ይጀምራል።ማራዘሚያው ሲጠናቀቅ አንድ ዑደት ይጠናቀቃል, እና የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ቁጥር በእጥፍ ይጨምራል.

እነዚህን ሶስት እርምጃዎች ከ25-35 ጊዜ በመድገም የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ቁጥር በከፍተኛ ደረጃ ይጨምራል።

የ PCR ብልሃት የተለያዩ ፕሪመርስ ለተለያዩ ዒላማ ጂኖች ሊነደፉ ስለሚችሉ የታለመው የጂን ቁርጥራጮች በአጭር ጊዜ ውስጥ ሊጨመሩ ይችላሉ።

እስካሁን ድረስ PCR በሶስት ምድቦች ማለትም ተራ PCR, fluorescent quantitative PCR እና ዲጂታል PCR ሊከፈል ይችላል.

ተራ PCR የመጀመሪያው ትውልድ

የታለመውን ጂን ለማጉላት ተራ የ PCR ማጉያ መሳሪያ ይጠቀሙ እና ምርቱን ለማግኘት አጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ይጠቀሙ, የጥራት ትንተና ብቻ ሊደረግ ይችላል.

የመጀመሪያው ትውልድ PCR ዋና ጉዳቶች-

- ላልተወሰነ ማጉላት እና የውሸት አወንታዊ ውጤቶች የተጋለጠ።

- ማወቂያው ረጅም ጊዜ ይወስዳል እና ቀዶ ጥገናው አስቸጋሪ ነው.

- የጥራት ሙከራ ብቻ ነው የሚሰራው።

ሁለተኛ-ትውልድ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR

Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR) በመባልም የሚታወቀው qPCR በመባል የሚታወቀው የፍሎረሰንት ሲግናሎች ክምችት በፍሎረሰንት ምልክቶች በመከማቸት የፍሎረሰንት መመርመሪያዎችን በመጨመር ውጤቱን በፍሎረሰንት ከርቭ በኩል ለመዳኘት ይጠቅማል።

የqPCR ቴክኖሎጂ የሚከናወነው በተዘጋ ስርዓት ውስጥ ስለሆነ የብክለት እድሉ ቀንሷል ፣ እና የፍሎረሰንት ምልክቱ በቁጥር ለመለየት ቁጥጥር ሊደረግበት ስለሚችል በክሊኒካዊ ልምምድ ውስጥ በሰፊው ጥቅም ላይ የዋለ እና በ PCR ውስጥ ዋነኛው ቴክኖሎጂ ሆኗል።

በእውነተኛ ጊዜ የፍሎረሰንት መጠናዊ PCR ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉት የፍሎረሰንት ንጥረ ነገሮች በ TaqMan fluorescent probes፣ ሞለኪውላር ቢኮኖች እና የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች ሊከፋፈሉ ይችላሉ።

1) TaqMan የፍሎረሰንት መጠይቅ:

በ PCR ማጉላት ወቅት ጥንድ ፕሪመር ሲጨመር አንድ የተወሰነ የፍሎረሰንት መጠይቅ ይታከላል።መመርመሪያው ኦሊጎኑክሊዮታይድ ሲሆን ሁለቱ ጫፎች በቅደም ተከተል በሪፖርተር ፍሎረሰንት ቡድን እና በ quencher fluorescent ቡድን ምልክት ይደረግባቸዋል።

መመርመሪያው ሳይበላሽ ሲቀር, በሪፖርተሩ ቡድን የሚወጣው የፍሎረሰንት ምልክት በማጥፋት ቡድን ይጠመዳል;በ PCR ማጉላት ወቅት የ 5′-3′ exonuclease እንቅስቃሴ የታክ ኢንዛይም ፈልቅቆ ምርመራውን በማዋረድ ዘጋቢውን ፍሎረሰንት ቡድን እና ኳንቸር ያደርገዋል የፍሎረሰንት ቡድን ተለያይቷል ስለዚህም የፍሎረሰንት ቁጥጥር ስርዓቱ የፍሎረሰንስ ምልክትን ይቀበላል ፣ ማለትም ፣ የዲ ኤን ኤ ገመድ በተጠናከረ ቁጥር ፣ የፍሎረሰንት ሞለኪውል ይመሰረታል ፣ የፍሎረሰንት ምልክት ይፈጠራል እና የፍሎረሰንት ሞለኪውል ይባላል። ከ PCR ምርት መፈጠር ጋር.

2) SYBR የፍሎረሰንት ማቅለሚያዎች፡-

በ PCR ምላሽ ስርዓት፣ ከመጠን በላይ የ SYBR ፍሎረሰንት ቀለም ይታከላል።የSYBR ፍሎረሰንት ቀለም ልዩ በሆነ መልኩ በዲኤንኤ ድርብ-ፈትል ውስጥ ካልተካተተ በኋላ የፍሎረሰንት ምልክት ያወጣል።በሰንሰለቱ ውስጥ ያልተካተተ የ SYBR ቀለም ሞለኪውል ምንም አይነት የፍሎረሰንት ምልክት አያወጣም, በዚህም የፍሎረሰንት ምልክትን ያረጋግጣል የ PCR ምርቶች መጨመር ከ PCR ምርቶች መጨመር ጋር ሙሉ በሙሉ ይመሳሰላል.SYBR የሚይዘው ከድርብ-ክር ዲ ኤን ኤ ጋር ብቻ ነው፣ ስለዚህ የማቅለጫው ከርቭ PCR ምላሽ የተወሰነ መሆኑን ለመወሰን ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል።

3) ሞለኪውላር ቢኮኖች

በ 5 እና 3 ጫፎች ላይ ወደ 8 የሚጠጉ የፀጉር መርገጫዎችን የሚፈጥር ግንድ-ሉፕ ባለ ሁለት ምልክት የሆነ ኦሊጎኑክሊዮታይድ መጠይቅ ነው።በሁለቱም ጫፎች ላይ ያሉት የኑክሊክ አሲድ ቅደም ተከተሎች እርስ በርስ ተጣምረው ተጣምረው ነው, ይህም የፍሎረሰንት ቡድን እና የጠቋሚው ቡድን ጥብቅ ይሆናል.ዝጋ, ፍሎረሰንት አይፈጥርም.

የ PCR ምርት ከተፈጠረ በኋላ, በማደንዘዣው ሂደት ውስጥ, የሞለኪውላር ቢኮን መካከለኛ ክፍል ከተወሰነ የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተል ጋር ተጣምሯል, እና የፍሎረሰንት ጂን ከኪንቸር ጂን ተለይቷል ፍሎረሰንት ይፈጥራል.

የሁለተኛ-ትውልድ PCR ዋና ጉዳቶች-

ስሜታዊነት አሁንም ይጎድላል፣ እና ዝቅተኛ ቅጂ ያላቸው ናሙናዎችን ማግኘት ትክክል አይደለም።

የበስተጀርባ እሴት ተጽእኖ አለ, ውጤቱም ለመጠላለፍ የተጋለጠ ነው.

የሶስተኛ ትውልድ ዲጂታል PCR

ዲጂታል PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) የዒላማ ቅደም ተከተሎችን ቅጂ ቁጥር በመጨረሻ ነጥብ ማወቂያ ያሰላል እና የውስጥ መቆጣጠሪያዎችን እና መደበኛ ኩርባዎችን ሳይጠቀም ትክክለኛ ፍፁም የቁጥር ማወቂያን ማከናወን ይችላል።

ዲጂታል PCR የመጨረሻ ነጥብ ማወቂያን ይጠቀማል እና በሲቲ እሴት (የዑደት ገደብ) ላይ አይመሰረትም, ስለዚህ የዲጂታል PCR ምላሽ በአጉሊ መነፅር ውጤታማነት ብዙም አይጎዳውም, እና ለ PCR ምላሽ አጋቾች ያለው መቻቻል በከፍተኛ ትክክለኛነት እና እንደገና መባዛት ይሻሻላል.

ምክንያት ከፍተኛ ትብነት እና ከፍተኛ ትክክለኛነት ባህሪያት, በቀላሉ PCR ምላሽ አጋቾቹ ጣልቃ አይደለም, እና ምርምር እና ማመልከቻ ነጥብ ሆኗል ያለ መደበኛ ምርቶች, እውነተኛ ፍጹም quantification ለማሳካት ይችላሉ.

እንደ የምላሽ ክፍል የተለያዩ ቅርጾች, በሶስት ዓይነቶች ሊከፈል ይችላል-ማይክሮፍሉዲክ, ቺፕ እና ነጠብጣብ ስርዓቶች.