Ⅰ. የምላሽ ስርዓቱን ስሜታዊነት ይጨምሩ;

1. የተለየ ከፍተኛ ጥራት ያለው አር ኤን ኤ;

የተሳካ ሲዲኤንኤ ውህደት የሚመጣው ከፍተኛ ጥራት ካለው አር ኤን ኤ ነው።ከፍተኛ ጥራት ያለው አር ኤን ኤ ቢያንስ በአጠቃላይ ረዘም ላለ ጊዜ ማረጋገጥ አለበት እና እንደ EDTA ወይም SDS ያሉ ቀረጻ ኢንዛይሞች የሌላቸው አጋቾችን አልያዘም።የአር ኤን ኤ ጥራት ወደ ሲዲ ኤን ኤ መገልበጥ የሚችሉትን የተከታታይ መረጃ ከፍተኛውን ዋጋ ይወስናል።አጠቃላይ የአር ኤን ኤ የመንጻት ዘዴ isoocyanate/acidophenol የመጠቀም ደረጃ ዘዴ ነው።የ RNase ብክለትን ለመከላከል አር ኤን ኤ በ RNase የበለፀገ ናሙና (እንደ ቆሽት ያሉ) የተለየ ጥራት ያለው አር ኤን ኤ ለመቆጠብ ፎርማለዳይድ ማከማቸት ያስፈልገዋል, ይህም ለረጅም ጊዜ ማከማቻነት የበለጠ ነው.ከአይጥ ጉበት የሚወጣው አር ኤን ኤ በመሠረቱ አንድ ሳምንት በውሃ ውስጥ ከተከማቸ በኋላ የተበላሸ ሲሆን ከአይጥ ስፕሊን የወጣው አር ኤን ኤ ደግሞ በውሃ ውስጥ ከተቀመጠ ከሶስት አመት በኋላ የተረጋጋ ሆኖ ቆይቷል።በተጨማሪም፣ ከ4kb በላይ የሆኑ ግልባጮች ከአነስተኛ ግልባጮች ይልቅ የ RNase መበላሸትን ለመከታተል የበለጠ ስሜታዊ ናቸው።የማጠራቀሚያው አር ኤን ኤ ናሙና መረጋጋት ለመጨመር አር ኤን ኤ በሜታልማሚን ኦፍ ion ውስጥ ሊሟሟ ይችላል እና -70 ° ሴ ይከማቻል።አር ኤን ኤ ለመቆጠብ የሚያገለግለው ታይላይድ አር ኤን ኤ የሚቀንስ ልዩ ልዩ ነገር መያዝ የለበትም።ከቆሽት የሚመነጨው አር ኤን ኤ በሜታልማሚን ቢያንስ ለአንድ አመት ሊድን ይችላል።አር ኤን ኤን ለመጠቀም ዝግጁ ሲሆኑ የሚከተሉትን ዘዴዎች መጠቀም ይችላሉ አር ኤን ኤ : NaCl ወደ 0.2m እና 4 ጊዜ የኢታኖል መጠን ይጨምሩ, የክፍል ሙቀት ለ 3-5 ደቂቃዎች እና 10,000 × g ሴንትሪፉጋል ለ 5 ደቂቃዎች ይጨምሩ.

2. ያለ RNaseH እንቅስቃሴ (RNaseH-) በግልባጭ ትራንስክሪፕት ይጠቀሙ፡-

RNase inhibitors ብዙውን ጊዜ የሲዲኤንኤ ውህደትን ርዝመት እና ምርት ለመጨመር ወደ ግልባጭ ግልባጭ ምላሾች ይታከላሉ።RNase inhibitor በመጀመርያው የሰንሰለት ውህደት ምላሽ ውስጥ ተጨምሯል ቋጠሮዎች ባሉበት እና እንደ ዲቲቲ ያሉ ወኪሎችን የሚቀንሱ ናቸው ምክንያቱም የቅድመ-cDNA ውህደት ሂደት አጋቾቹን ስለሚቀንስ አር ኤን ኤን የሚያበላሹ የታሰሩ RNases ይለቀቃል።ፕሮቲን RNase inhibitor አር ኤን ኤ በ RNase A, B, C መበላሸትን ብቻ ይከላከላል, እና RNases በቆዳ ላይ አይከላከልም, ስለዚህ እነዚህን አጋቾቹ ቢጠቀሙም RNases ን ከጣቶች እንዳይገቡ ጥንቃቄ መደረግ አለበት.

የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ አር ኤን ኤ ወደ ሲዲኤንኤ መለወጥን ያበረታታል።ሁለቱም M-MLV እና AMV ከራሳቸው የ polymerase እንቅስቃሴ በተጨማሪ ውስጣዊ የ RNaseH እንቅስቃሴ አላቸው።የ RNaseH እንቅስቃሴ በአር ኤን ኤ አብነቶች እና በዲኤንኤ ፕሪመርሮች ወይም በሲዲኤንኤ ማራዘሚያ መካከል ለተፈጠሩት heterozygous ዘርፎች ከ polymerase እንቅስቃሴ ጋር ይወዳደራል፣ እና አር ኤን ኤ ያዋርዳል፡ በዲኤንኤ ውስብስቦች ውስጥ ያሉ የአር ኤን ኤ ክሮች።በRNaseH እንቅስቃሴ የተበላሹ አር ኤን ኤ አብነቶች ከአሁን በኋላ የሲዲኤንኤ ውህደትን ምርት እና ርዝመትን በመቀነስ እንደ ውጤታማ ተተኪዎች መጠቀም አይችሉም።ስለዚህ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ የ RNaseH እንቅስቃሴን ማስወገድ ወይም በእጅጉ መቀነስ ትልቅ ጥቅም ይኖረዋል።

ሱፐር ስክሪፕትⅡ የተገላቢጦሽ ግልባጭ፣ MMLV የ RNaseH በግልባጭ እና ቴርሞስክሪፕት በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴ፣ የ RNaseH AMV - ከኤምኤምኤልቪ እና ከኤኤምቪ የበለጠ ሙሉ ርዝመት ያለው ሲዲኤንኤ አፍርቷል።የ RT-PCR ትብነት በ cDNA በተሰራው መጠን ይጎዳል።ቴርሞስክሪፕት ከ AMV የበለጠ ስሜታዊ ነው።የRT-PCR ምርቶች መጠን የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትዝ ሲዲኤንኤን የማዋሃድ ችሎታ የተገደበ ነው፣በተለይ ትላልቅ ሲዲናዎችን በሚዘጉበት ጊዜ።ከኤምኤምኤልቪ ጋር ሲነጻጸር፣ SuperScripⅡ የረጅም RT-PCR ምርቶችን ምርት በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል።የ RNaseH-'s reverse transcriptase በተጨማሪም የሙቀት መረጋጋትን ይጨምራል, ስለዚህ ምላሹ ከተለመደው ከ 37-42 ℃ በላይ በሆነ የሙቀት መጠን ሊከናወን ይችላል.በተጠቆሙት የውህደት ሁኔታዎች፣ oligo(dT) primers እና 10μCi [alpha-p] dCTP ጥቅም ላይ ውለዋል።የመጀመሪያው ሰንሰለት አጠቃላይ ምርት በቲሲኤ የዝናብ ዘዴ በመጠቀም ይሰላል።ባለሙሉ ርዝመት ሲዲኤንኤ የተተነተነው በመጠን-የተደረደረ የዝርፊያ ማስወገጃ እና በአልካላይን አጋሮዝ ጄል ውስጥ በመቁጠር ነው።

3. የተገላቢጦሽ ግልባጭ የሙቀት መከላከያ ሙቀትን ይጨምሩ;

ከፍተኛ የሙቀት መጠን ያለው የሙቀት መጠን የአር ኤን ኤውን ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ለመክፈት እና የምላሹን ምርት ለመጨመር ይረዳል.ለአብዛኛዎቹ አር ኤን ኤ አብነቶች አር ኤን ኤ እና ፕሪመርን በ65 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ያለ ቋት ወይም ጨው በመያዝ ከዚያም በበረዶ ላይ በፍጥነት ማቀዝቀዝ አብዛኞቹን ሁለተኛ ደረጃ አወቃቀሮችን ያስወግዳል እና ፕሪመርዎቹ እንዲተሳሰሩ ያስችላቸዋል።ነገር ግን፣ አንዳንድ አብነቶች አሁንም የሙቀት denaturation በኋላ እንኳ ሁለተኛ መዋቅር አላቸው.እነዚህን አስቸጋሪ አብነቶች ማጉላት ThermoScript reverse transcriptase በመጠቀም እና የተገላቢጦሹን የትራንስክሪፕት ምላሽ ከፍ ባለ የሙቀት መጠን በማስቀመጥ ማጉላትን ማሻሻል ይቻላል።ከፍ ያለ የሙቀት መጠን መጨመርም ልዩነቱን ሊጨምር ይችላል፣ በተለይም ሲዲኤንኤ ውህደት በጂን-ተኮር ፕሪመር (ጂኤስፒኤስ) ሲከናወን (ምዕራፍ 3 ይመልከቱ)።ጂኤስፒን የሚጠቀሙ ከሆነ የፕሪመርሩ ቲም ዋጋ ከሚጠበቀው የሙቀት መጠን ጋር ተመሳሳይ መሆኑን ያረጋግጡ።oligo(dT) እና የዘፈቀደ ፕሪመር ከ60℃ በላይ አይጠቀሙ።ወደ 60 ℃ ከመጨመራቸው በፊት የዘፈቀደ ፕሪመር በ 25 ℃ ለ 10 ደቂቃዎች መያዝ ያስፈልጋል።ከፍተኛ የተገላቢጦሽ ሙቀቶችን ከመጠቀም በተጨማሪ አር ኤን ኤ/ፕሪመር ድብልቅን ከ65 ℃ ዴንትራይንግ የሙቀት መጠን ወደ ተገላቢጦሽ የፅሁፍ ማዘዣ የሙቀት መጠን በማስተላለፍ እና ቀድሞ የተሞቀ 2× ምላሽ ቅልቅል (የሲዲኤንኤ የሙቀት መነሳሳት ውህድ) በመጨመር ልዩነቱን ማሻሻል ይቻላል።ይህ አቀራረብ በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ውስጥ የሚከሰተውን ኢንተርሞለኩላር ቤዝ ጥንድን ለመከላከል ይረዳል.PCR መሳሪያ መጠቀም ለ RT-PCR የሚያስፈልጉትን ብዙ የሙቀት መቀየሪያዎችን ቀላል ያደርገዋል።

Tth heat stabilized polymerase እንደ ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ሆኖ Mg2+ እና RNA polymerase በ Mn2+ ፊት ይሰራል።እስከ 65 ℃ ድረስ ሙቀትን ይይዛል.ነገር ግን፣ በ PCR ወቅት Mn2+ መኖሩ ታማኝነትን ይቀንሳል፣ ይህም Tth polymerase ለከፍተኛ ትክክለኛነት ማጉላት፣ እንደ ሲዲ ኤን ኤ ክሎኒንግ ተስማሚ ያልሆነ ያደርገዋል።በተጨማሪም Tth በተገላቢጦሽ ወደ ጽሁፍ መገልበጥ ብዙም ቅልጥፍና ያለው አይደለም፣ ይህም ስሜትን ይቀንሳል፣ እና አንድ ኢንዛይም በግልባጭ ግልባጭ እና PCR ሊያከናውን ስለሚችል፣ በግልባጭ ግልባጭ ሳይደረግ የቁጥጥር ምላሾችን የሲዲኤንኤ ምርቶችን ከተበከለ ጂኖም ዲ ኤን ኤ ለመለየት መጠቀም አይቻልም።

4. የተገላቢጦሽ ግልባጭን የሚያበረታታ ተጨማሪ፡

ግሊሰሪን እና ዲኤምኤስኦን ጨምሮ ተጨማሪዎች ወደ የመጀመሪያው ሰንሰለት ውህደት ምላሽ የኒውክሊክ አሲድ ድርብ ክር መረጋጋት ሊቀንስ እና የአር ኤን ኤ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅርን ያስወግዳል።የሱፐርስክሪፕትⅡ ወይም ኤምኤምኤልቪ እንቅስቃሴን ሳይነካ እስከ 20% glycerin ወይም 10% DMSO መጨመር ይቻላል።AMV እንቅስቃሴን ሳይቀንስ እስከ 20% ጋሊሰሮልን መቋቋም ይችላል።በሱፐር ስክሪፕትⅡ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ምላሽ የ RT-PCR ስሜትን ከፍ ለማድረግ 10% ግሊሰሮል በ 45 ℃ ላይ መጨመር እና መከለል ይችላል።የ retrotranscription-reaction ምርት 1/10 በ PCR ውስጥ ከተጨመረ, በማጉላት ምላሽ ውስጥ ያለው የ glycerol ክምችት 0.4% ነው, ይህም PCRን ለመግታት በቂ አይደለም.

5. RNaseH ሂደት;

ከ PCR በፊት የሲዲኤንኤ ውህደት ግብረመልሶችን ከ RNaseH ጋር በማከም ስሜታዊነት ሊሻሻል ይችላል።ለአንዳንድ አብነቶች፣ በሲዲኤንኤ ውህደት ምላሽ ውስጥ ያለው አር ኤን ኤ የተጨመሩ ምርቶችን መያያዝን ይከለክላል ተብሎ ይታሰባል፣ በዚህ ጊዜ የ RNaseH ህክምና ስሜትን ሊጨምር ይችላል።በአጠቃላይ፣ በአንጻራዊ ረጅም ሙሉ ርዝመት ያለው የሲዲኤንኤ ዒላማ አብነት ለማጉላት RNaseH ህክምና ያስፈልጋል፣ ለምሳሌ እንደ tuberous scherosisⅡ ከዝቅተኛ ቅጂ ጋር።ለዚህ አስቸጋሪ አብነት፣ RNaseH በሱፐር ስክሪፕትⅡ ወይም AMV በተሰራው ሲዲኤንኤ የሚፈጠረውን ምልክት አሻሽሏል።ለአብዛኛዎቹ የ RT-PCR ምላሾች፣ የ RNaseH ህክምና አማራጭ ነው ምክንያቱም 95℃ ኢንሱሌድ PCR denaturation እርምጃ አር ኤን ኤውን ከአር ኤን ኤ፡ ዲኤንኤ ውስብስብ ያደርገዋል።

6. አነስተኛ መጠን ያለው አር ኤን ኤ ለመለየት የተሻሻሉ ዘዴዎች;

RT-PCR በተለይ አነስተኛ መጠን ያለው አር ኤን ኤ ሲገኝ በጣም ፈታኝ ነው።በአር ኤን ኤ መለያየት ወቅት ግሉኮጅንን እንደ ተሸካሚ መጨመር የትንሽ ናሙናዎችን ምርት ለመጨመር ይረዳል.ከRNase-ነጻ glycogen ከTrizol ጋር በተመሳሳይ ጊዜ ሊጨመር ይችላል።ግሉኮጅን በውሃ ውስጥ የሚሟሟ እና በውሃው ክፍል ውስጥ በአር ኤን ኤ ውስጥ ሊቆይ ይችላል, ይህም ለቀጣይ ዝናብ ይረዳል.የሚመከረው የ RNase-free glycogen ትኩረት 250μg/ml ነው ናሙናዎች ከ 50mg ላላነሱ ቲሹ ወይም 106 የሰለጠኑ ሴሎች።

ሱፐር ስክሪፕት Ⅱን በመጠቀም አሲቴላይትድ ቢኤስኤ ሲጨመር የመገለባበጥ ስሜትን ይጨምራል፣ እና ለአነስተኛ አር ኤን ኤ መጠን የሱፐር ስክሪፕትⅡ መጠን በመቀነስ እና 40 ዩኒት የ RnaseOut nuclease inhibitor መጨመር የመለየት ደረጃን ያሻሽላል።ግላይኮጅንን በአር ኤን ኤ መለያየት ጥቅም ላይ ከዋለ፣ ሱፐር ስክሪፕት Ⅱን በመጠቀም የጽሑፍ ግልባጭ ምላሽን ለመቀየር BSA ወይም RNase inhibitors መጨመር አሁንም ይመከራል።

Ⅱ. የ RT-PCR ልዩነት ይጨምሩ

1. የ cNDA ውህደት;

የመጀመሪያውን ሲዲኤንኤ ውህደት ለመጀመር ሶስት የተለያዩ ዘዴዎችን መጠቀም ይቻላል፣ እና የእያንዳንዱ ዘዴ አንጻራዊ ልዩነት በ cDNA የተቀናጀውን መጠን እና አይነት ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል።

የዘፈቀደ ፕሪመር ዘዴ ከሦስቱ ዘዴዎች ውስጥ በጣም ትንሹ የተለየ ነው።አጭር፣ ከፊል ርዝመት ሲዲኤንኤ ለማምረት ፕሪመርሮች በበርካታ ጣቢያዎች ላይ በጽሁፉ ውስጥ በሙሉ ተሰርዘዋል።ይህ ዘዴ ብዙውን ጊዜ 5′ ተርሚናል ቅደም ተከተሎችን እና ሲዲ ኤን ኤ ከአር ኤን ኤ አብነቶች ከሁለተኛ ደረጃ መዋቅራዊ ክልሎች ወይም ከተገለበጠ ድህረ ገፆች ለማግኘት ጥቅም ላይ ይውላል።ረጅሙን ሲዲኤን ለማግኘት በእያንዳንዱ የአር ኤን ኤ ናሙና ውስጥ የፕሪመርስ እና አር ኤን ኤ መካከል ያለው ጥምርታ በተጨባጭ ሁኔታ መወሰን አለበት።የዘፈቀደ ፕሪመርስ የመጀመሪያ ትኩረት በ 20μl ምላሽ ስርዓት ከ 50 እስከ 250ng ይደርሳል።በዘፈቀደ primers በመጠቀም ከጠቅላላ አር ኤን ኤ የተቀናበረው በዋነኛነት ራይቦሶማል አር ኤን ኤ ስለሆነ፣ ፖሊ(A)+RNA በአጠቃላይ እንደ አብነት ይመረጣል።

ኦሊጎ(ዲቲ) ጅምር ከዘፈቀደ ፕሪመር የበለጠ የተወሰነ ነው።በአብዛኛዎቹ eukaryotic ህዋሶች ውስጥ በ mRNA 3′ መጨረሻ ላይ ካለው ፖሊ(A) ጅራት ጋር ያዳቅላል።ፖሊ(A)+አር ኤን ኤ ከጠቅላላ አር ኤን ኤ ከ1% እስከ 2% ስለሚሆን የሲዲኤንኤ መጠን እና ውስብስብነት በዘፈቀደ ፕሪመርሮች ጥቅም ላይ ከዋለ በጣም ያነሰ ነው።በከፍተኛ ልዩነቱ ምክንያት oligo(dT) በአጠቃላይ ለአር ኤን ኤ እስከ ፕሪመር ሬሾ እና ፖሊ(A)+ ምርጫ ማመቻቸትን አይፈልግም።በ 20μl ምላሽ ስርዓት 0.5μg oligo(dT) ለመጠቀም ይመከራል።oligo(dT)12-18 ለአብዛኛዎቹ RT-PCR ተስማሚ ነው።ቴርሞስክሪፕት RT-PCR ሲስተም ጥሩ የሙቀት መረጋጋት ስላለው እና ለከፍተኛ የሙቀት መጠን መጨመር oligo(dT)20 ያቀርባል።

ጂን-specific primers (ጂኤስፒ) ለተገላቢጦሽ ግልባጭ ደረጃ በጣም የተሻሉ ፕሪመሮች ናቸው።ጂኤስፒ እንደ የዘፈቀደ ፕሪመር ወይም ኦሊጎ(ዲቲ) ያሉ ሁሉንም Rnas ከማደንዘዝ ይልቅ በተለይ በአር ኤን ኤ መድረሻ ቅደም ተከተል ሊዳቀል የሚችል አንቲሴንስ oligonucleoside ነው።PCR primers ለመንደፍ ጥቅም ላይ የሚውሉት ደንቦች በግልባጭ የጽሑፍ ምላሽ GSP ንድፍ ላይም ይሠራሉ።ጂኤስፒ በ mRNA3 መጨረሻ ላይ ካለው የማጉላት ፕሪመር ጋር ተመሳሳይ ቅደም ተከተል ሊሆን ይችላል፣ ወይም ጂኤስፒ በተገላቢጦሽ ማጉያ ፕሪመር ወደ ታች ተፋሰስ እንዲደረግ ሊነደፍ ይችላል።ለአንዳንድ አምፕሊፋይድ ነገሮች፣ ለተሳካ RT-PCR ከአንድ በላይ አንቲሴንስ ፕሪመር ማዘጋጀት አስፈላጊ ነው ምክንያቱም የዒላማው አር ኤን ኤ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ፕሪመርን ከማሰር ሊከላከል ይችላል።1pmol አንቲሴንስ ጂኤስፒን በ 20μl የመጀመሪያ ሰንሰለት ውህደት ስርዓት ውስጥ ለመጠቀም ይመከራል።

2. የተገላቢጦሽ ግልባጭ የሙቀት መከላከያ ሙቀትን ይጨምሩ;

የጂኤስፒ ልዩነትን ሙሉ በሙሉ ለመጠቀም፣ ከፍተኛ የሙቀት መረጋጋት ያለው የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት ጥቅም ላይ መዋል አለበት።የሙቀት-የተረጋጋ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ በከፍተኛ የሙቀት መጠን ሊገለበጥ ይችላል ምላሽ ጥብቅነትን ለመጨመር።ለምሳሌ፣ ጂኤስፒ በ55 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ላይ ከተሰረዘ፣ የጂኤስፒ ልዩነት ሙሉ በሙሉ ጥቅም ላይ የሚውለው በግልባጭ በ 37°C ዝቅተኛ ጥብቅነት AMV ወይም M-MLV በመጠቀም ከሆነ ነው።ሆኖም ሱፐርስክሪፕⅡ እና ቴርሞስክሪፕት በ50 ℃ ወይም ከዚያ በላይ ምላሽ ሊሰጡ ይችላሉ፣ ይህም በዝቅተኛ የሙቀት መጠን የሚመረቱ ልዩ ያልሆኑ ምርቶችን ያስወግዳል።ለከፍተኛ ልዩነት፣ አር ኤን ኤ/ፕሪመር ድብልቅ በቀጥታ ከ65 ℃ ዲናቹሬሽን የሙቀት መጠን ወደ ተገላቢጦሽ የጽሑፍ ማቆያ የሙቀት መጠን ቀድመው በማሞቅ 2 x ምላሽ ድብልቅ (የ cDNA ውህደት የሙቀት መነሳሳት) ጋር ሊተላለፍ ይችላል።ይህ በዝቅተኛ የሙቀት መጠን በሞለኪውሎች መካከል የመሠረት ጥምርን ለመከላከል ይረዳል።PCR መሳሪያን መጠቀም ለ RT-PCR የሚያስፈልጉትን ብዙ የሙቀት ሽግግሮች ቀላል ያደርገዋል።

3. የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ብክለትን ይቀንሱ;

በ RT-PCR ላይ ሊኖር የሚችል ችግር አር ኤን ኤ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ መበከሉ ነው።እንደ ትሪዞል ሬጀንት ያሉ የተሻሉ አር ኤን ኤ የመለያ ዘዴዎችን መጠቀም በአር ኤን ኤ ዝግጅቶች ውስጥ የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ብክለትን ይቀንሳል።ከጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ የሚመረቱ ምርቶችን ለማስቀረት፣ አር ኤን ኤ ከመገለባበጡ በፊት የተበከለውን ዲ ኤን ኤ ለማስወገድ በማጉላት ደረጃ በDnasⅠ መታከም ይችላል።የDNaseⅠ መፈጨትን ለማቋረጥ ናሙናዎቹ በ 65℃ በ2.0mM EDTA ለ10 ደቂቃ ተጠብቀዋል።EDTA በከፍተኛ ሙቀት ውስጥ የሚከሰተውን የማግኒዚየም ion ጥገኛ የሆነውን አር ኤን ኤ ሃይድሮሊሲስን ለመከላከል የማግኒዚየም ions ን ያጸዳል።

አምፕሊፋይድ ሲዲኤንን ከጂኖም ዲ ኤን ኤ ማጉላት ምርት ለመለየት፣ ከተለየው ኤክሶን ጋር ለየብቻ የሚሰርዙ ፕሪመርሮች ሊነደፉ ይችላሉ።ከሲዲኤንኤ የሚመነጩ PCR ምርቶች ከብክለት ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ከተገኙት ያነሱ ይሆናሉ።የተሰጠው ቁርጥራጭ ከጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ወይም ሲዲኤንኤ መሆኑን ለማወቅ በግልባጭ የጽሁፍ ቅጂ የሌለበት ቁጥጥር የሚደረግበት ሙከራ በእያንዳንዱ አር ኤን ኤ አብነት ላይም ይከናወናል።የተገላቢጦሽ ጽሑፍ በማይኖርበት ጊዜ የተገኙ PCR ምርቶች ከጂኖም የተገኙ ናቸው.

ተዛማጅ ምርት

RT-PCR ቀላል^ᵀᴹእኔ (አንድ እርምጃ)

-የአንድ-እርምጃ ኪት በግልባጭ መገለባበጥ እና PCR በተመሳሳይ ቱቦ ውስጥ እንዲሰራ ያስችለዋል።አብነት አር ኤን ኤን፣ የተወሰኑ PCR ፕሪመርሮችን እና ከRNase-ነጻ ddH ማከል ብቻ ነው የሚያስፈልገው₂O.

- ስለ አር ኤን ኤ የእውነተኛ ጊዜ አሃዛዊ ትንተና በፍጥነት እና በትክክል ሊከናወን ይችላል።

- ኪት ልዩ የForegene በግልባጭ ወደ ግልባጭ reagent እና Foregene HotStar Taq ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴን ከተለየ የምላሽ ስርዓት ጋር በማጣመር የምላሹን የማጉላት ቅልጥፍና እና ልዩነት ይጠቀማል።

-የተመቻቸ የምላሽ ስርዓት ምላሹ ከፍ ያለ የመለየት ስሜት፣ ጠንካራ የሙቀት መረጋጋት እና የተሻለ መቻቻል እንዲኖረው ያደርገዋል።

RT Easy II(ከGDNase ጋር) ማስተር ፕሪሚክስ ለመጀመሪያ መስመር የሲዲኤንኤ ውህደት ለእውነተኛ ጊዜ PCR ከጂዲናሴ ጋር

በ2 ደቂቃ ውስጥ gDNA ን በአብነት ውስጥ ማስወገድ የሚችል gDNA ን የማስወገድ ብቃት።

- ቀልጣፋ የተገላቢጦሽ ግልባጭ ሥርዓት፣ የመጀመሪያውን ሲዲኤንኤ ውህደቱን ለማጠናቀቅ 15 ደቂቃ ብቻ ይወስዳል።

-ውስብስብ አብነቶች፡ ከፍተኛ የጂሲሲ ይዘት ያላቸው እና ውስብስብ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ያላቸው አብነቶች በከፍተኛ ቅልጥፍና ሊገለበጡ ይችላሉ።

-ከፍተኛ-ስሜታዊነት የተገላቢጦሽ ግልባጭ ሥርዓት፣ pg-ደረጃ አብነቶች ከፍተኛ ጥራት ያለው ሲዲኤንኤ ማግኘት ይችላሉ።

- የተገላቢጦሽ ግልባጭ ሲስተም ከፍተኛ የሙቀት መረጋጋት አለው ፣ ጥሩው የምላሽ ሙቀት 42 ℃ ነው ፣ እና አሁንም በ 50 ℃ ላይ ጥሩ የተገላቢጦሽ አፈፃፀም አለው።