ሁሉም ሰው የሚያወራው ስለ qRT-PCR ሙከራ፣ የፕሪመር ዲዛይን፣ የውጤት አተረጓጎም ወዘተ መርህ ነው፣ነገር ግን የqRT-PCR የሙከራ ስራን ላካፍልዎ የሚገባ ይመስለኛል።ትንሽ ነው, ግን ስለ ውጤት ነው.

qRT-PCR ን ከማድረግዎ በፊት የራሳችንን አር ኤን ኤ እና የአሠራር ዘዴዎች ግልጽ ግንዛቤ ሊኖረን ይገባል።ደግሞም ጥረታችን በቀላሉ ከመለማመድ ይልቅ ውጤት ለማምጣት ነው።ስለዚህ qRT-PCR ከማድረግዎ በፊት የሚከተሉትን ጉዳዮች መወሰን አለብን (አንዳንዶቹ በSYBR ላይ ብቻ ተፈጻሚ ይሆናሉ)።

1 የእርስዎ አር ኤን ኤ እንዳልተበላሸ እርግጠኛ ነዎት?

ናኖዶፕ 2000 የአር ኤን ኤ ትኩረትን እና ንፅህናን ብቻ ነው ማወቅ የሚችለው፣ ነገር ግን የአር ኤን ኤውን ትክክለኛነት መለየት አይችልም።

የአር ኤን ኤ (አር ኤን ኤ ኢንቲስቲቲት ቁጥር) እሴት በአግሊንት 2100 ባዮአናላይዘር ሲስተም የተገኘውን የአር ኤን ኤውን ትክክለኛነት ሊያንፀባርቅ ይችላል።

ምስል፡ ለተለያዩ የአር ኤን ኤ ናሙናዎች ( eukaryotes) የ RIN እሴቶች ንድፍ አውጪ

ነገር ግን፣ ላቦራቶሪዎች በአጠቃላይ Agilent 2100 Bioanalyzer የላቸውም።በዚህ ሁኔታ በፎርማለዳይድ ጄል በኩል መለየት እንችላለን ነገር ግን ለጠቅላላው የአር ኤን ኤ መጠን ከፍተኛ ነው, ስለዚህ በጣም ፈጣኑ ዘዴ ተራ ጄል ኤሌክትሮፊዮሬሲስን መጠቀም ነው.ከኒውክሊየስ ነፃ በሆነ አካባቢ ውስጥ መሆን ይጠበቅበታል, ስለዚህ ኤሌክትሮፊዮራይዝስ ታንክን, ሶል ጠርሙስን, ጄል ቅንፍ እና ማበጠሪያውን በ DEPC ውሃ ማጠብ አስፈላጊ ነው.አጋሮሱ ከኒውክሊዝ የጸዳ ነው (አዲስ እስከተከፈተ ድረስ) እና Loading Buffer በተቻለ መጠን አዲስ መከፈት አለበት፣ በ1.2% ጄል።

በሥዕሉ ላይ ባለው ናሙና 9 ላይ እንደሚታየው ጄል ሙሉ በሙሉ መሟሟት እንዳለበት ልብ ይበሉ, አለበለዚያ ግን ተመሳሳይነት የሌላቸው ባንዶችን ያስከትላል.ቮልቴጁ በጣም ከፍተኛ ከሆነ ወይም ለረጅም ጊዜ የሚሠራ ከሆነ ሙቀትን ያመነጫል እና የአር ኤን ኤ መበላሸት ያስከትላል, ስለዚህ ቮልቴጅ እና ጊዜ በተገቢው ሁኔታ መቆጣጠር አለባቸው.በተጨማሪም ጄል ሩጫ በናሙናው ውስጥ የዲኤንኤ ቅሪት መኖሩን የበለጠ ሊወስን ይችላል፣ እና በማከፋፈያው ጉድጓድ ውስጥ ብዙ ቁጥር ያላቸው የተያዙ ባንዶች መኖራቸውን ይመልከቱ።

ምስልጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ አር ኤን ኤ መለየት

2 ስለ ሲዲኤንኤዎ ትኩረት እርግጠኛ ነዎት?

በቤተ ሙከራ ውስጥ የታላላቅ ወንድሞች ልምድ በእያንዳንዱ ተገላቢጦሽ የተገኘው የ 20 ul ስርዓት ሲዲ ኤን ኤ በቀጥታ በ 20X, የድህረ-ዶክትሬት እህቶች ደግሞ 10X.እኔ ብዙውን ጊዜ እንደ ሁኔታው ​​​​ላይ ጥገኛ ነኝ.በእያንዳንዱ ሰው የተጠቀሰው አር ኤን ኤ ጥራት የተለየ ስለሆነ የመገለባበጥ ደረጃም እንዲሁ የተለየ ነው, እና የተገላቢጦሽ ቴክኖሎጂ የተረጋጋ ላይሆን ይችላል.

ስለዚህ የተገለበጠውን ሲዲኤን ባገኘሁ ቁጥር በመጀመሪያ 3 ጊዜ ያህል እጨምረዋለሁ እና የቤት አያያዝን ጂን ተጠቅሜ RT-PCR ን ለመስራት የዑደቶች ብዛት በአጠቃላይ 25 ዑደቶች ናቸው ፣ ልዩ ትኩረትን ለመለየት እና የመጨረሻውን የመሟሟት ሁኔታ ለመወሰን።

3 እርግጠኛ ነዎት የእርስዎ ፕሪመርቶች ለመጠቀም ቀላል ናቸው?

የqRT-PCR መቅለጥን ማለፍ ይችላል፣ ነገር ግን ይህ አሁንም ገንዘብ ያስወጣል።ብዙ ገንዘብ ለሌላቸው ላቦራቶሪዎች ብዙ ፕሪመር ሲያገኙ ተራውን RT-PCR ን በመጠቀም ነጠላ ባንድ መሆኑን ለማየት እና የፕሪሚኖችን ልዩነት መለየት ይችላሉ።ላቦራቶሪው የገንዘብ እጥረት ከሌለው, የሁሉም ፕሪመርቶች ልዩነት በሟሟ ኩርባ በኩል አንድ ጊዜ ሊታወቅ ይችላል.

4 የእርስዎ የሙከራ ሁኔታዎች ተስማሚ መሆናቸውን እርግጠኛ ነዎት?

SYBR ከጠንካራ ብርሃን የተጠበቀ መሆን አለበት፣ስለዚህ የSYBR reagent ሲጨምሩ የላይኛውን መብራቱን ለማጥፋት ይሞክሩ፣ እና እሱን ለማጠናቀቅ ደብዛዛ ብርሃን ብቻ መጠቀም ያስፈልግዎታል።

SYBR በ4°ሴ ያከማቹ።ጥቅም ላይ በሚውልበት ጊዜ አረፋ እንዳይፈጠር በደንብ ለመደባለቅ ቀስ ብለው ወደ ላይ እና ወደ ታች ይገለበጡ እና በኃይል አይዙሩ።

አንዳንድ ታናሽ እህቶች ናሙናዎችን እንዳይቀላቀሉ በመፍራት በ PCR ሰሌዳ ላይ ምልክቶችን መሳል ይወዳሉ፣ ይህ ስህተት ነው።ጠቋሚዎችዎ በፍሎረሰንት ሲግናሎች ስብስብ ላይ ተጽእኖ ሊያሳድሩ ስለሚችሉ፡ ከዚህ በታች እንደሚታየው ጁኒየር ለሙከራ ማስታወሻ ደብተር እንዲጠቀሙ እመክራለሁ።

ምስልqRT-PCR ናሙና የመጫኛ ንድፍ

5 በትክክል እየሰሩት እንደሆነ እርግጠኛ ነዎት?

ጓንት ማድረግ, ጓንት ማድረግ, ጓንት ማድረግ እና አስፈላጊ ነገሮችን ሶስት ጊዜ መናገርዎን እርግጠኛ ይሁኑ.

የSYBR ለብርሃን መጋለጥን ለመቀነስ እኔ በግሌ ከዚህ በታች በምስሉ ላይ እንደሚታየው አብነት ማከል እወዳለሁ።በተሞክሮ መሰረት, ትንሽ መጠን ያለው አብነት መጨመር የናሙና ስህተቶችን ሊያስከትል ይችላል.ስለዚህ, ትንሽ አብነት በመጨመር የተፈጠረውን ስህተት ለመቀነስ, ብዙውን ጊዜ ናሙናውን እንደገና በእጥፍ እጨምራለሁ, እና ናሙናውን ሲጨምር የ H2O2 መጠንን ለመቀነስ.

ምስልየqRT-PCR ጭነት ንድፍ ንድፍ

ከዚያ የqRT-PCR ስርዓቱን እንደሚከተለው ያዋቅሩት።

ምስልqRT-PCR ስርዓት ዝግጅት ንድፍ

ማሳሰቢያ: የማዋቀሩ ሂደት በበረዶ ላይ መደረግ አለበት.

ናሙናውን ካከሉ ​​በኋላ, ግልጽ የማተሚያ ፊልም ይለጥፉ.ገላጭ የማተሚያ ፊልምን በእጆችዎ ላይ ላለመንካት ይሞክሩ, በፊልሙ በሁለቱም በኩል ካለው ቦታ ላይ ብቻ ይስሩ.ምክንያቱም የጣት አሻራዎች የፍሎረሰንት ምልክቶች ስብስብ ላይ ተጽእኖ ሊያሳድሩ ስለሚችሉ ነው።ከዚያም ናሙናው ግድግዳው ላይ እንዳይሰቀል ለመከላከል በዝቅተኛ ፍጥነት ለ 10 ሰከንድ በፍጥነት ሴንትሪፉጅ ይጠቀሙ።

ተዛማጅ ምርቶች፡

የሕዋስ ቀጥታ RT-qPCR ስብስብ

RT ቀላል II