በqPCR ሙከራዎች፣ የፕሪመር ንድፍ እንዲሁ በጣም አስፈላጊ አገናኝ ነው።ፕሪመርዎቹ ተስማሚ ይሁኑ ወይም አይሆኑ የማጉላት ቅልጥፍና ወደ ደረጃው ከመድረሱ፣ የተጨመሩት ምርቶች ልዩ ከመሆናቸው እና የሙከራው ውጤት ከመገኘቱ ጋር በቅርበት የተያያዘ ነው።
ስለዚህ የqPCR primer specificity እንዴት የተሻለ ማድረግ እንደሚቻል?ከፍተኛ የማጉላት ብቃት?
ዛሬ፣ የqPCR primersን አንድ ላይ እንድትቀርጽ እንወስድሃለን፣ እና የqPCR primer ንድፍ በሙከራዎች ውስጥ ቀልጣፋ የጥበብ ችሎታ እንድትሆን እናድርግ።
የ qPCR ፕሪመርቶችን በሚሰሩበት ጊዜ ብዙውን ጊዜ ለሚከተሉት ነጥቦች ትኩረት ይስጡ-ፕሪመርሮች በተቻለ መጠን በመግቢያው ላይ የተነደፉ መሆን አለባቸው ፣ የምርት ርዝመት 100-300 bp ፣ የቲኤም እሴት በተቻለ መጠን ወደ 60 ° ሴ ቅርብ መሆን አለበት ፣ እና የላይኛው እና የታችኛው የታችኛው ክፍል በተቻለ መጠን ቅርብ መሆን አለበት ፣ እና የፕሪም መጨረሻው G ወይም C መሆን አለበት ፣ ወዘተ.
1. መግቢያዎችን የሚሸፍኑ የፕሪመርስ ንድፍ
የqPCR ፕሪመርቶችን በሚነድፉበት ጊዜ በመግቢያው ላይ የተነደፉ ፕሪመርሮችን መምረጥ የgDNA አብነት እንዳይጨምር ይከላከላል፣ እና ምርቶቹ ሁሉም ከሲዲኤንኤን ማጉላት የተገኙ ናቸው፣ ይህም የ gDNA ብክለትን ተፅእኖ ያስወግዳል።
2. የፕሪመር ርዝመት
የፕሪመር ርዝመት በአጠቃላይ ከ18-30 nt ነው, እና የማጉላት ምርቱ ርዝመት በተቻለ መጠን ከ100-300 bp መካከል ቁጥጥር ሊደረግበት ይገባል.
ፕሪመር በጣም አጭር ከሆነ, ወደ ልዩ ያልሆነ ማጉላት ይመራዋል, እና በጣም ረጅም ከሆነ, በቀላሉ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር (እንደ የፀጉር አሠራር) ይፈጥራል.የማጉላት ምርቱ በጣም ረጅም ከሆነ, ለ polymerase ምላሽ ተስማሚ አይደለም, ይህም የ PCR ማጉላትን ውጤታማነት ይጎዳል.
3. የጂሲ ይዘት እና የቲኤም እሴት
የጂ.ሲ.ሲ የፕሪመርሮች ይዘት በ40% እና 60% መካከል ቁጥጥር ሊደረግበት ይገባል።በጣም ከፍ ያለ ወይም በጣም ዝቅተኛ ከሆነ, ምላሹን ለመጀመር ተስማሚ አይደለም.ተመሳሳዩን የቲኤም እሴት እና የማቀዝቀዝ ሙቀትን ለማግኘት የፊት እና የተገላቢጦሽ ፕሪመር የጂሲ ይዘት ወደ ተመሳሳይ ቅርብ መሆን አለበት።
የቲኤም ዋጋ በተቻለ መጠን ከ55-65°ሴ፣በአጠቃላይ በ60°ሴ አካባቢ፣እና የላይ እና የታችኛው ተፋሰስ Tm ዋጋ በተቻለ መጠን ቅርብ መሆን አለበት፣በተቻለም ከ4°C ያልበለጠ።
4. በፕሪመር 3′ መጨረሻ ላይ A ከመምረጥ ይቆጠቡ
የፕሪመር 3′ ፍፃሜ ሳይዛመድ ሲቀር፣የተለያዩ መሰረቶች ውህደት ውጤታማነት ላይ ትልቅ ልዩነቶች አሉ።የመጨረሻው መሠረት A ሲሆን, በተዛባ ሁኔታ ውስጥም ቢሆን የሰንሰለት ውህደትን ሊጀምር ይችላል, እና የመጨረሻው መሰረት ቲ በሚሆንበት ጊዜ, አለመመጣጠን የማስተዋወቅ ውጤታማነት በእጅጉ ይቀንሳል.ስለዚህ, በፕሪሚየር 3' ጫፍ ላይ A ከመምረጥ ለመቆጠብ ይሞክሩ, እና T ን መምረጥ የተሻለ ነው.
የፍተሻ ፕሪመር ከሆነ የፍተሻው 5′ ጫፍ G ሊሆን አይችልም ምክንያቱም አንድ ነጠላ ጂ ቤዝ ከኤፍኤም ፍሎረሰንት ዘጋቢ ቡድን ጋር ሲገናኝ እንኳን G በ FAM ቡድን የሚወጣውን የፍሎረሰንት ምልክት ሊያጠፋ ስለሚችል የውሸት አሉታዊ ውጤቶችን ያስከትላል።ይታይ።
5. የመሠረት ስርጭት
የአራቱ መሰረቶች በፕሪመር ውስጥ መሰራጨቱ በዘፈቀደ ይመረጣል፣ በ3′ መጨረሻ ከ3 ተከታታይ G ወይም C በላይ እና ከ3 ተከታታይ በላይ እንዳይሆን ማድረግ።G ወይም C በጂሲ-በለጸገው ተከታታይ ክልል ውስጥ ጥንዶችን ለመፍጠር ቀላል ናቸው።
6. የፕሪመር ዲዛይን ክልል ውስብስብ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅሮችን ማስወገድ አለበት.
በማጉላት ምርቱ ነጠላ ፈትል የተገነባው ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር የ PCR ለስላሳ እድገት ላይ ተጽእኖ ይኖረዋል.በቅድሚያ በዒላማው ቅደም ተከተል ውስጥ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር መኖሩን በመተንበይ, ይህንን ክልል በፕሪመር ንድፍ ውስጥ ለማስወገድ ይሞክሩ.
7. ፕሪመርዎቹ እራሳቸው እና በፕሪም መካከል ያሉ ተከታታይ ማሟያ መሰረቶችን ለማስወገድ መሞከር አለባቸው.
በፕሪመር እራሱ እና በፕሪመር መካከል ምንም ተከታታይ 4 መሰረታዊ ማሟያ ሊኖር አይችልም.ፕሪመር እራሱ ተጨማሪ ቅደም ተከተል ሊኖረው አይገባም, አለበለዚያ የፀጉር መዋቅርን ለመመስረት እራሱን አጣጥፎ ይይዛል, ይህም የፕሪሚየር እና የአብነት ውህደቱ ላይ ተጽእኖ ይኖረዋል.
ተጨማሪ ቅደም ተከተሎች ከላይ እና ከታች በተፋሰሱ ፕሪም መካከል ሊኖሩ አይችሉም።በፕሪመርሮች መካከል ያለው ማሟያ የፕሪመር ዲመሮችን ያመነጫል, ይህም የ PCR ቅልጥፍናን ይቀንሳል አልፎ ተርፎም የቁጥር ትክክለኛነት ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል.የፕሪመር-ዲመር እና የፀጉር አወቃቀሮች ሊወገዱ የማይችሉ ከሆነ, የ △G ዋጋ በጣም ከፍ ያለ መሆን የለበትም (ከ 4.5 kcal / mol ያነሰ መሆን አለበት).
8. ፕሪመርሮች የታለመውን የተወሰነ ምርት ያጎላሉ.
የqPCR ማወቂያ የመጨረሻ ግብ የታለመውን ጂን ብዛት መረዳት ነው።ልዩ ያልሆነ ማጉላት ከተከሰተ, መጠኑ የተሳሳተ ይሆናል.ስለዚህ, ፕሪመርሮች ከተነደፉ በኋላ, በ BLAST መሞከር ያስፈልጋቸዋል, እና የምርቶቹ ልዩነት በቅደም ተከተል የውሂብ ጎታ ውስጥ ይነጻጸራል.
በመቀጠል፣ የqPCR ፕሪመርቶችን ለመንደፍ የሰውን GAS6 (የዕድገት ማቆያ ልዩ 6) ጂን እንደ ምሳሌ እንወስዳለን።
01 መጠይቅ ጂን
ሆሞ GAS6በ NCBI በኩል .እዚህ, የጂን ስም እና ዝርያን ለማነፃፀር ትኩረት መስጠት ያለብን ወጥነት ያለው መሆኑን ለማረጋገጥ ነው.
02 የጂን ቅደም ተከተል ያግኙ
(1) የዒላማው ቅደም ተከተል ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ከሆነ, የመጀመሪያውን ይምረጡ, እሱም የጂን ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተል ነው.
(2) የዒላማው ቅደም ተከተል mRNA ከሆነ, ሁለተኛውን ይምረጡ.ከገቡ በኋላ, ከታች ባለው ሠንጠረዥ ውስጥ "ሲዲኤስ" ን ጠቅ ያድርጉ.ቡናማው የጀርባ ቅደም ተከተል የጂን ኮድ ቅደም ተከተል ነው.
03 ንድፍ አውጪዎች
የPremer-BLAST በይነገጽ ያስገቡ
የጂን ቅደም ተከተል ቁጥር ወይም ቅደም ተከተሎችን በፋስታ ቅርጸት በላይኛው በግራ በኩል ያስገቡ እና ተዛማጅ መለኪያዎችን ይሙሉ።

"ፕሪመርን አግኝ" ን ጠቅ ያድርጉ እና NCBI እንደዚህ ያለ የመለኪያ ምርጫ ወደ ሌሎች የተከፋፈሉ ልዩነቶች እንደሚጨምር ይነግርዎታል።የተለያዩ የስፕሊንግ ተለዋጮችን እንፈትሻለን እና ተገቢውን ፕሪመር ጥንድ ለማግኘት (ከዚህ በታች ባለው ስእል እንደሚታየው) እናቀርባቸዋለን።ይህ ሂደት ለማሄድ አስር ሰከንዶች ሊወስድ ይችላል።
የእነዚህ ፕሪመር ጥንዶች የማቀዝቀዝ ሙቀት ሁሉም ወደ 60 ° ሴ አካባቢ ነው።በሙከራው ዓላማ መሰረት መጠነኛ ርዝመት ያላቸው ፕሪመርቶችን ይምረጡ, ጥሩ ልዩነት እና ለሙከራው የፕሪሚየር ማሟያ እምብዛም የማይሟሉ, እና የስኬት መጠኑ በጣም ከፍተኛ ነው!
04የመጀመሪያ ደረጃ ማረጋገጫ
በእርግጥ፣ ፕሪመርን ከመንደፍ በተጨማሪ፣ ፕሪመር-ብላስት እራሳችንን የፈጠርናቸውን ፕሪመርሮችም መገምገም ይችላል።ወደ የፕሪመር ንድፍ ገጽ ይመለሱ፣ እኛ የነደፍነውን ወደላይ እና ወደ ታች ፕሪመር ያስገቡ እና ሌሎች መለኪያዎች አይስተካከሉም።ካስገቡ በኋላ፣ ጥንዶቹ ፕሪመር በሌሎች ጂኖች ላይም መኖራቸውን ማየት ይችላሉ።ሁሉም ለማጉላት በፈለግነው ጂን ላይ ከታዩ የዚህ ጥንድ ፕሪሚየር ልዩነት በጣም ጥሩ መሆኑን ያሳያል!(ለምሳሌ፣ ይህ የፕሪመር መጠይቁ ብቸኛው ውጤት ነው!)

05 ዋና ጥራት ፍርድ
"የማጉላት ቅልጥፍናን እስከ መደበኛ", "የተጨመሩ የምርት ባህሪያት" እና "አስተማማኝ የሙከራ ውጤቶችን" የሚያጣምረው "ፍጹም" ፕሪመር ምን ዓይነት ፕሪመር ነው?
የማጉላት ብቃት

መቅለጥ ኩርባ
የፕሪሚየር ማጉላት ውጤታማነት ከ 90% -110% ይደርሳል, ይህ ማለት የማጉላት ቅልጥፍና ጥሩ ነው, እና የማቅለጫው ኩርባ አንድ ጫፍ እና አብዛኛውን ጊዜ Tm> 80 ° ሴ አለው, ይህ ማለት የማጉላት ልዩነቱ ጥሩ ነው.
 
ተዛማጅ ምርቶች፡
እውነተኛ ጊዜ PCR ቀላል–SYBR ግሪን I
እውነተኛ ጊዜ PCR ቀላል-ታክማን