የመነሻ ቁሳቁስ: አር ኤን ኤ
Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) በ PCR ሙከራዎች ውስጥ አር ኤን ኤ እንደ መነሻ ቁሳቁስ ጥቅም ላይ የሚውል የሙከራ ዘዴ ነው።በዚህ ዘዴ፣ አጠቃላይ አር ኤን ኤ ወይም መልእክተኛ አር ኤን ኤ (ኤምአርኤን) በመጀመሪያ ወደ ማሟያ ዲ ኤን ኤ (ሲዲኤንኤ) በግልባጭ ትራንስክሪፕት ይገለበጣል።በመቀጠል፣ cDNA እንደ አብነት በመጠቀም የqPCR ምላሽ ተካሂዷል።RT-qPCR በተለያዩ ሞለኪውላር ባዮሎጂ አፕሊኬሽኖች ውስጥ ጥቅም ላይ ውሏል፣ የጂን አገላለጽ ትንተና፣ የአር ኤን ኤ ጣልቃገብነት ማረጋገጫ፣ የማይክሮአረር ማረጋገጫ፣ በሽታ አምጪ ተህዋስያንን መለየት፣ የዘረመል ምርመራ እና የበሽታ ምርምርን ጨምሮ።
ለ RT-qPCR አንድ-ደረጃ እና ባለ ሁለት-ደረጃ ዘዴዎች
RT-qPCR በአንድ-ደረጃ ወይም ባለ ሁለት-ደረጃ ዘዴ ሊከናወን ይችላል።ባለ አንድ ደረጃ RT-qPCR የተገላቢጦሽ ግልባጭ እና PCR ማጉላትን በማጣመር የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴስ እና ዲኤንኤ ፖሊመሬዜን በተመሳሳዩ ቋት ሁኔታዎች ውስጥ በተመሳሳይ ቱቦ ውስጥ ያለውን ምላሽ እንዲያጠናቅቁ ያስችላቸዋል።ባለ አንድ ደረጃ RT-qPCR በቅደም ተከተል የተወሰኑ ፕሪምፖችን ብቻ መጠቀምን ይጠይቃል።በሁለት-ደረጃ RT-qPCR፣ የተገላቢጦሽ ግልባጭ እና PCR ማጉላት በሁለት ቱቦዎች ውስጥ ይከናወናሉ፣የተለያዩ የተመቻቹ ቋቶች፣ የምላሽ ሁኔታዎች እና የፕሪመር ዲዛይን ስልቶች።
| ጥቅም | ጉዳቱ | |
| አንድ እርምጃ | ሁለቱም ምላሾች በአንድ ቱቦ ውስጥ ስለሚደረጉ ይህ ዘዴ አነስተኛ የሙከራ ስህተት አለው
ጥቂት የቧንቧ መስመሮች የብክለት አደጋን ይቀንሳሉ
ለከፍተኛ ደረጃ ማጉላት/ማጣራት፣ ፈጣን እና ሊባዛ የሚችል | ባለ ሁለት ደረጃ ምላሾች በተናጥል ማመቻቸት አይችሉም
የሁለት-እርምጃ ምላሽን በማጣመር የምላሽ ሁኔታዎች የተበላሹ ስለሆኑ ፣ የስሜታዊነት ስሜት እንደ ሁለት-ደረጃ ዘዴ ጥሩ አይደለም።
በአንድ ናሙና የተገኙ የዒላማዎች ብዛት ትንሽ ነው |
| ሁለት ደረጃዎች | ለረጅም ጊዜ ሊቀመጡ የሚችሉ እና ለብዙ ምላሾች ጥቅም ላይ ሊውሉ የሚችሉ የተረጋጋ የሲዲኤንኤ ቤተ-ፍርግሞችን የመፍጠር ችሎታ
የዒላማ ጂኖች እና የማጣቀሻ ጂኖች ብዙ የሲዲኤንኤ ቤተ-መጽሐፍት ሳያስፈልጋቸው ከተመሳሳይ የሲዲኤንኤ ቤተ-መጽሐፍት ሊጨመሩ ይችላሉ.
የነጠላ ምላሽ ሩጫዎችን ማመቻቸትን የሚያነቃቁ የምላሽ ማቋረጫዎች እና የምላሽ ሁኔታዎች
የመቀስቀስ ሁኔታዎች ተለዋዋጭ ምርጫ | ብዙ ቱቦዎችን መጠቀም እና ተጨማሪ የቧንቧ መስመሮችን በመጠቀም የዲኤንኤ ብክለትን ይጨምራል. እና ጊዜ የሚወስድ.
ከአንድ-ደረጃ ዘዴ የበለጠ ማመቻቸትን ይጠይቃል |
ተዛማጅ ምርቶች፡
RT-qPCR Easyᵀᴹ (አንድ እርምጃ)-SYBR አረንጓዴ I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (አንድ እርምጃ)-ታቅማን
RT Easyᵀᴹ I ማስተር ፕሪሚክስ ለመጀመሪያ-ክር ሲዲኤንኤ ውህደት
ሪል ጊዜ PCR Easyᵀᴹ-SYBR አረንጓዴ አይ ኪት።
የአጠቃላይ አር ኤን ኤ እና ኤምአርኤን ምርጫ
የRT-qPCR ሙከራን በሚነድፍበት ጊዜ አጠቃላይ አር ኤን ኤ ወይም የተጣራ ኤምአርኤን በግልባጭ ወደ ጽሑፍ ቅጂ ለመጠቀም እንደ አብነት መወሰን አስፈላጊ ነው።ምንም እንኳን ኤምአርኤን ትንሽ ከፍ ያለ ስሜትን መስጠት ቢችልም፣ አጠቃላይ አር ኤን ኤ አሁንም በተደጋጋሚ ጥቅም ላይ ይውላል።ይህ የሆነበት ምክንያት አጠቃላይ አር ኤን ኤ ከ mRNA ይልቅ እንደ መነሻ ቁሳቁስ የበለጠ ጠቃሚ ጠቀሜታ ስላለው ነው።በመጀመሪያ፣ ሂደቱ ጥቂት የመንጻት እርምጃዎችን ይፈልጋል፣ ይህም የአብነት የተሻለ መጠናዊ መልሶ ማግኛ እና የተሻለ የሕዋስ ቁጥሮችን ወደ መደበኛው ውጤት ማምጣትን ያረጋግጣል።በሁለተኛ ደረጃ፣ የተለያዩ ኤምአርኤንኤን የማበልፀግ እርምጃን ያስወግዳል፣ ይህም በተለያዩ ኤምአርኤንኤዎች መልሶ ማግኛ ምክንያት የተዛባ ውጤቶችን ሊያስከትል ይችላል።በአጠቃላይ፣ በአብዛኛዎቹ አፕሊኬሽኖች ውስጥ የዒላማው ዘረ-መል (ጂን) አንጻራዊ መመዘኛ ከመለየቱ ፍፁም ስሜታዊነት የበለጠ አስፈላጊ ስለሆነ አጠቃላይ አር ኤን ኤ በአብዛኛዎቹ ሁኔታዎች ተስማሚ ነው።
የተገላቢጦሽ ግልባጭ ፕሪመር
በሁለት-ደረጃ ዘዴ፣ የሲዲኤንኤ ምላሽን ለማስተዋወቅ ሶስት የተለያዩ ዘዴዎችን መጠቀም ይቻላል፡ oligo(dT) primers፣ random primers ወይም ተከታታይ-ተኮር ፕሪመር።በተለምዶ፣ oligo(dT) primers እና random primers በጥምረት ጥቅም ላይ ይውላሉ።እነዚህ ፕሪመርሮች የአብነት ኤምአርኤን ፈትል ይሰርዛሉ እና የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕት ለውህደት መነሻ ነጥብ ይሰጣሉ።
| ዋና ምርጫ | መዋቅር እና ተግባር | ጥቅም | ጉዳቱ |
| ኦሊጎ(ዲቲ) ፕሪመር (ወይም መልህቅ ኦሊጎ(ዲቲ) ፕሪመር) | በኤምአርኤን ፖሊ(A) ጅራት ላይ ወደ ታይሚን ቅሪቶች የተራዘመ ማደንዘዣ;መልህቅ ኦሊጎ(ዲቲ) ፕሪመር በ3′ መጨረሻ (መልሕቅ ቦታ) G፣ C ወይም A ይዟል። | የሙሉ ርዝመት ሲዲኤንኤ ከፖሊ(A) -ጭራ mRNA
ያነሰ መነሻ ቁሳቁስ ሲገኝ ተፈጻሚ ይሆናል።
መልህቅ ቦታ የ oligo(dT) ፕሪመር ከኤምአርኤንኤ 5′ ፖሊ(A) ጅራት ጋር መገናኘቱን ያረጋግጣል። | በፖሊ (A) ጭራዎች ጂኖችን ለማጉላት ብቻ ተስማሚ ነው
ከዋናው ቦታ*2 በፖሊ(A) የተቆረጠ ሲዲኤን ያግኙ
እስከ 3′ መጨረሻ ድረስ ለማሰር ያዳላ*
* መልህቅ oligo(dT) primers ጥቅም ላይ ከዋለ ይህ ዕድል ይቀንሳል |
| የዘፈቀደ ፕሪመር
| ከ6 እስከ 9 መሠረቶች ርዝማኔ፣ ይህም በአር ኤን ኤ ግልባጭ ወቅት ወደ ብዙ ቦታዎች ሊሰርዝ ይችላል። | የሁሉም አር ኤን ኤዎች (tRNA፣ rRNA እና mRNA)
ጉልህ የሆነ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ላለው ግልባጭ ፣ ወይም አነስተኛ የመነሻ ቁሳቁስ ሲገኝ ተስማሚ
ከፍተኛ የሲዲኤንኤ ምርት | ሲዲ ኤን ኤ ከሁሉም አር ኤን ኤ የተገለበጠ ነው፣ ይህም አብዛኛውን ጊዜ የማይፈለግ እና የዒላማውን የኤምአርኤን ሲግናል ሊያደበዝዝ ይችላል።
ሲዲ ኤን ኤ ይቆረጣል |
| ቅደም ተከተል-ተኮር ፕሪመር | የተወሰኑ mRNA ቅደም ተከተሎችን የሚያነጣጥሩ ብጁ ፕሪመርሮች | የተወሰነ የሲዲኤንኤ ቤተ-መጽሐፍት
ስሜታዊነትን አሻሽል።
የተገላቢጦሽ qPCR ፕሪመርቶችን በመጠቀም | የአንድ ዒላማ ዘረ-መል ውህደት ብቻ የተወሰነ |
የተገላቢጦሽ ግልባጭ
የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ ዲኤንኤን ለማዋሃድ አር ኤን ኤ የሚጠቀም ኢንዛይም ነው።አንዳንድ የተገላቢጦሽ ግልባጮች የ RNase እንቅስቃሴ አላቸው እና ከተገለበጡ በኋላ በ RNA-DNA hybrid strands ውስጥ ያሉ የአር ኤን ኤ ዘርፎችን ሊያዋርዱ ይችላሉ።የ RNase ኢንዛይም እንቅስቃሴ ከሌለው፣ RNaseH ለከፍተኛ የqPCR ቅልጥፍና ሊታከል ይችላል።በብዛት ጥቅም ላይ የዋሉ ኢንዛይሞች Moloney murine leukemia ቫይረስ ሪቨርስ ትራንስክሪፕትሴ እና አቪያን ማይሎብላስቶማ ቫይረስ ተቃራኒ ትራንስክሪፕትሴን ያካትታሉ።ለ RT-qPCR ፣ ከፍተኛ የሙቀት መቆጣጠሪያ ያለው የተገላቢጦሽ ግልባጭ መምረጥ ተስማሚ ነው ፣ ስለሆነም ሲዲኤንኤ ውህደት በከፍተኛ ሙቀት ሊከናወን ይችላል ፣ ይህም ከፍተኛ ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ያላቸውን አር ኤን ኤዎች በተሳካ ሁኔታ መገለባበጡ ፣ በምላሹ በሙሉ ሙሉ እንቅስቃሴያቸውን እየጠበቁ ፣ ይህም ከፍተኛ የሲዲኤንኤ ምርትን ያስከትላል።
ተዛማጅ ምርቶች፡
የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትስ የ RNase H እንቅስቃሴ
RNaseH የአር ኤን ኤ ክሮች ከአር ኤን ኤ-ዲ ኤን ኤ ዱፕሌክስ ዝቅ ማድረግ ይችላል፣ ይህም ድርብ-ክር ያለው ዲ ኤን ኤ በብቃት እንዲዋሃድ ያስችላል።ነገር ግን፣ ረጅም ኤምአርኤን እንደ አብነት ሲጠቀሙ፣ አር ኤን ኤው ያለጊዜው ሊዋረድ ይችላል፣ በዚህም ምክንያት የተቆረጠ ሲዲኤንኤ።ስለዚህ የረጅም ግልባጮች ውህደት ከተፈለገ በሲዲኤንኤ ክሎኒንግ ወቅት የ RNaseH እንቅስቃሴን መቀነስ ብዙ ጊዜ ጠቃሚ ነው።በአንጻሩ፣ ከ RNase H እንቅስቃሴ ጋር የተገላቢጦሽ ግልባጮች ብዙውን ጊዜ ለqPCR አፕሊኬሽኖች ጠቃሚ ናቸው ምክንያቱም በፒሲአር የመጀመሪያ ዑደት ውስጥ የ RNA-DNA duplexes መቅለጥን ስለሚያሳድጉ።
የፕሪመር ንድፍ
በ RT-qPCR ውስጥ ለqPCR እርከን ጥቅም ላይ የሚውሉ PCR primers በሐሳብ ደረጃ የኤክስሰን-ኤክሰን መገናኛን ለመዘርጋት የተነደፉ መሆን አለባቸው፣ ይህም የማጉላት ፕሪመር ትክክለኛውን የ exon-intron ወሰን ሊሸፍን ይችላል።የውስጠ-የያዙ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተሎች ስላልጨመሩ ይህ ንድፍ የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ እንዳይበከል የተጋነኑ የውሸት አወንታዊ ውጤቶችን ይቀንሳል።
ፕሪመር ኤክሶን ወይም ኤክሰን-ኤክሰን ድንበሮችን ለመለየት ካልተነደፉ፣ የጂኖም ዲ ኤን ኤ ብክለትን ለማስወገድ የአር ኤን ኤ ናሙናዎችን ከRNase-free DNase I ወይም dsDNase ጋር ማከም አስፈላጊ ሊሆን ይችላል።
RT-qPCR ቁጥጥር
የዲኤንኤ መበከልን ለመለየት (እንደ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ወይም PCR ምርቶች ካለፉት ምላሾች ያሉ) የተገላቢጦሽ ግልባጭ አሉታዊ ቁጥጥር (-RT መቆጣጠሪያ) በሁሉም የRT-qPCR ሙከራዎች ውስጥ መካተት አለበት።ይህ መቆጣጠሪያ ከተገላቢጦሽ ግልባጭ በስተቀር ሁሉንም የምላሽ ክፍሎችን ይይዛል።የተገላቢጦሽ ግልባጭ በዚህ መቆጣጠሪያ ስለማይከሰት፣ PCR ማጉላት ከታየ፣ ከዲኤንኤ መበከል ብዙ ነው።
የልጥፍ ሰዓት፡- ኦገስት-02-2022
